De Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit (kolomgebaseerd) zet snel ongemethyleerde cytosines in DNA-monsters om in uracil, terwijl gemethyleerde cytosines onveranderd blijven. Tijdens de behandeling met bisulfiet bij hoge temperaturen denatureert dubbelstrengs DNA tot enkelstrengs DNA. In aanwezigheid van HSO3- ondergaan cytosineresiduen deaminering en worden omgezet in uracil, waarbij gemethyleerde cytosines onveranderd blijven. Bij daaropvolgende PCR-amplificatie wordt uracil vervangen door thymine (T). Het conversieproces duurt slechts 5 minuten, waarbij DNA-input van 100 pg tot 2 μg mogelijk is, en bereikt een conversie-efficiëntie van ≥99% voor ongemethyleerde cytosines. Het geconverteerde DNA is geschikt voor downstream-toepassingen zoals PCR-amplificatie en NGS-sequencing.

Functie

Lage invoer: Geschikt voor het omzetten van monsters van 100 pg naar 2 μg

Korte conversietijd: ongeveer 5 minuten.

Minimale monsterschade: Behoud van een goede monsterintegriteit na conversie.

Hoge conversie-efficiëntie: Conversiepercentage ≥99%, hoge conversiepercentages in regio's met een hoog GC-gehalte met een laag percentage vals-positieve resultaten.

Geschikt voor zeldzame monsters, zoals de methylering van DNA in afzonderlijke cellen.

Kan RNA-monsters omzetten in methylering.

Product Componenten

Opmerking:

Voor 10 tests per doos: Voeg 4,4 ml watervrije ethanol toe aan de wasoplossing.

Voor 50 tests per doos: Voeg 22 ml watervrije ethanol toe aan de wasoplossing.

Na het toevoegen van de watervrije ethanol, omkeren en goed mengen, en vervolgens bewaren voor toekomstig gebruik. Zorg ervoor dat de dop van de fles goed gesloten is om te voorkomen dat de ethanol verdampt, wat de prestaties van het reagens zou kunnen beïnvloeden.

Figuur

Figuur 4. Bisulfietconversie op menselijke genomische DNA-monsters werd uitgevoerd met zowel de 12225- als de concurrent Q-conversiekits. Vervolgens werden methyleringsspecifieke enkelstrengs DNA-bibliotheekvoorbereidingskits gebruikt om bibliotheken te genereren. De bibliotheekopbrengst en kwaliteitscontrolegegevens worden hierboven gepresenteerd. De resultaten tonen aan dat bij het sequencen van de gepoolde bibliotheken van zowel de 12225- als de concurrent Q-kits, de 12225-kit een hogere data-output opleverde, een hogere on-target-ratio (%) bereikte en lagere duplicatiepercentages (%) vertoonde.

Verzending en opslag

Bewaar 12225-A conversieoplossing bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Bewaar andere componenten bij kamertemperatuur. De houdbaarheid is 12 maanden.

Opmerking:

1. Om het succes van downstream experimenten te garanderen, moet u de totale hoeveelheid input-DNA nauwkeurig kwantificeren tijdens de conversiestap. Het wordt aanbevolen om Qubit 3.0/4.0 te gebruiken voor DNA-kwantificering, met een A260/A280-verhouding tussen 1,7 en 1,9. Het input-DNA-bereik moet tussen 100 pg en 2 μg liggen, met een optimaal bereik van 100 ng tot 1 μg. Onvoldoende DNA-invoer kan downstream detectie belemmeren, terwijl overmatige invoer de recovery en conversie-efficiëntie kan verminderen.

2. De conversieoplossing, desulfoneringsoplossing en wasoplossing bevatten vluchtige componenten. Draai na gebruik de doppen direct dicht en bewaar ze op kamertemperatuur.

3. Ga voor post-conversie monsters direct verder met downstream experimenten. Voor korte termijn opslag, bewaar op -20°C, en voor lange termijn opslag, bewaar op -80°C.

4. Draag voor uw eigen veiligheid en gezondheid tijdens de operatie een laboratoriumjas en wegwerphandschoenen.

5. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden!

Instructies

Bereiding van reagentia en verbruiksartikelen: Steriele centrifugebuis van 1,5 ml, enzymvrij water, absolute ethanol, PCR-buis;

ik Bisulfietconversie:

1) Bereid de overeenkomstige steriele PCR-buis voor op basis van het aantal te testen monsters en bereid het reactiesysteem voor volgens de volgende tabel:

2) Transformatiesysteem

Gebruik een pipet om het bovenstaande systeem te blazen en te mengen, of vortex en meng het gedurende 5 seconden, centrifugeer het vervolgens kort en centrifugeer de reactieoplossing tot de bodem van de PCR-buis.

v Opmerking: 1. Op dit moment is het totale volume van de reactieoplossing in de PCR-buis 200 μL. Om de transformatie completer te maken, moet de reactieoplossing in gelijke delen worden verdeeld en worden overgebracht naar een nieuwe steriele PCR-buis na het blazen en mengen in stap 2), en moet de transformatieprocedure worden uitgevoerd. Na de conversie werden de reactieoplossingen in de twee PCR-buizen gecombineerd in dezelfde zuiveringskolom voor zuivering.

2. Als het monstervolume tussen 20 en 40 μL ligt, verminder dan het volume van de transformatieoplossing tot een totaalvolume van 200 μL.

3. Als het monstervolume 50 μL bedraagt, wordt 150 μL van de transformatieoplossing toegevoegd, wordt het totale volume op 200 μL gehouden en wordt de transformatietijd verlengd tot 6-10 min.

3) Instellen van CT-conversieprogramma

De PCR-buis wordt op een PCR-instrument geplaatst met een vooraf ingesteld programma om de reactie uit te voeren.

ik Zuivering

1) T200 μL van de conversie oplossing voor de Purificatie kolomS, centrifugeer gedurende 30-60 s 13000 Ggooi het filtraat weg en plaats de zuiveringskolom in de CverzamelbuisS opnieuw;

2) Voeg 100 μL toe Wasbuffer naar binnen Zuiveringskolommen (bevestig dat absolute ethanol is toegevoegd), centrifugeer gedurende 30-60 s 13000 Ggooi het filtraat weg en plaats de zuiveringskolom in de CverzamelbuisS opnieuw;

3) Voeg 200 μL toe Desulfoneringsbuffer in de Zuiveringskolommen , en laat de reactie 20 min. bij kamertemperatuur staan. Na de reactie 30-60 s centrifugeren 13000 Ggooi het filtraat weg en plaats de Zuiveringskolommen in de CverzamelbuisS opnieuw;

4) Voeg 200 μL van de Wasbuffer naar de Zuiveringskolommen, centrifugeer gedurende 30-60 s 13000 G gooi het filtraat weg en plaats de Purificatie kolomS in de CverzamelbuisS opnieuw;

5) Herhaal stap 4) eenmaal;

6) Overdracht van de Zuiveringskolommen Voeg aan de voorbereide centrifugebuis van 1,5 ml 10-30 μL toe Elutiebuffer naar het midden van het filtermembraan na het openen van de deksel en het drogen, en verzamel de DNA na 1 min staan ​​bij kamertemperatuur en 1 min centrifugeren bij 13000 G;

7) Bewaar de DNA tijdelijk bij -20 ℃. Voor langdurige opslag, bewaar de DNA bij -80 ℃ en vermijd onnodig herhaaldelijk invriezen en ontdooien.

Let op: Het gezuiverde transformatieproduct kan direct worden gebruikt in de daaropvolgende PCR-reactie of het sequentieproces.

Handmatig