Hieff NGS® DNA&RNA Bibliotheek Co-Prep Kit V2 is een DNA&RNA co-library kit voor het Illumina®&MGI® sequencing platform, dat efficiënte cDNA synthese reagens en enzyme digestie reagens bevat. Vergeleken met de traditionele bibliotheek bouw methode, dit product kan efficiënt cDNA-synthese en DNA&RNA-bibliotheek voltooien bouw in één tube. De kit bevat hoogwaardige enzymen voor DNA-fragmentatie en combineert DNA-fragmentatie, eindreparatie en dA-tailing in één stap, wat de tijd en kosten van bibliotheekvoorbereiding aanzienlijk verkort. Deze bibliotheekvoorbereidingskit heeft een uitstekende bibliotheekconversieratio en is toepasbaar op monsters van alle gangbare dieren, planten, micro-organismen, enz., en ook de FFPE-monsters. Deze geüpgradede kit met de nieuwste geoptimaliseerde ligase verlaagt de zelfligatieratio tijdens adapterligatie aanzienlijk. Bovendien verbetert de introductie van een nieuwe high-fidelity polymerase de homogeniteit en betrouwbaarheid van amplificatie verder.

Alle onderdelen van de kit zijn onderworpen aan een strenge kwaliteitscontrole en functionele verificatie, waardoor de stabiliteit en herhaalbaarheid van de bibliotheekconstructie optimaal worden gewaarborgd.

Specificaties

Componenten

Opmerking: * geeft aan dat dit reagens niet in deze kit is inbegrepen en dat er extra reagentia nodig zijn.De kit is compatibel met twee platforms van Verlicht^®&MGI^®, maar extra primermix (CAT # 13334 Primer Mix voor MGI^® en Cat# 13335 Primer Mix voor Illumina^®) is vereist.

Werkstroom:

Opslag

Dit product moet worden bewaard bij -25~-15℃ gedurende 1 jaar.

Notities

Over de operatie

1. 1. Voor uw eigen veiligheid draagt ​​u een labjas en wegwerphandschoenen.
2. Laat de componenten ontdooien op kamertemperatuur.Na het ontdooien, meng het geheel grondig door te vortexen, draai de buisjes kort rond en zet ze op ijs voor later gebruik.
3. Het wordt aanbevolen om elke reactiestap uit te voeren in een thermocycler met een verwarmd deksel. De thermocycler moet voor gebruik worden voorverwarmd tot de ingestelde temperatuur.
4. Gebruik verbruiksartikelen zonder RNasebesmetting en het schoonmaken van het experimentele gebied regelmatig. ThermoFisher's RNAZap^TM Er werd een spray met een hoge efficiëntie voor het verwijderen van nucleïnezuur aanbevolen om RNase-verontreiniging te verwijderen.
5. Bij onjuiste handelingen is de kans groot dat er aerosolverontreinigingen ontstaan, waardoor de nauwkeurigheid van de resultaten wordt beïnvloed.Verplichte fysieke isolatie van PCR-reactiemenggebieden en PCR-productzuiveringsassaygebieden wordt aanbevolen. Uitgerust met apparatuur zoals gespecialiseerde pipetten voor bibliotheekconstructie.
6. 6. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.

Adapter Ligatie

1. Klanten kunnen kiezen uit Illumina of MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kits en korte Adapter kits, afhankelijk van hun experimentele vereisten.
2. Het werd aanbevolen om hoogwaardige, commerciële adapters te selecteren. Als u zelfgemaakte adapters selecteert, vertrouw dan een bedrijf toe met ervaring in NGS-primersynthese en merk op dat er strikte contaminatiecontrole nodig is. Daarnaast wordt aanbevolen om DNA-annealingoplossing te bereiden in een schone werkbank en slechts één type adapter per keer te gebruiken om kruisbesmetting te voorkomen.
3. Laat de adapters ontdooien op ijs of bij 4°C. Bij gebruik op kamertemperatuur mag de laboratoriumtemperatuur niet hoger zijn dan 25°C om te voorkomen dat de adapters denatureren.
4. De concentratie van de adapter heeft direct invloed op de ligatie-efficiëntie en de opbrengst van de bibliotheek. Het adaptervolume dat aan de kit wordt toegevoegd, is vastgesteld op 5 μl. Het wordt aanbevolen om de adapters te verdunnen met 0,1×TE-buffer en de verdunde adapters kunnen 48 uur bij 4°C worden bewaard. Tabel1 geeft de aanbevolen adapterhoeveelheid weer voor verschillende hoeveelheden invoer-RNA.

Tabel 1-1 De aanbevolen Illumina^® adapterbedrag voor verschillende invoer DNA en RNA

Tabel 1-2 De aanbevolen MGI^® adapterbedrag voor verschillende invoer DNA en RNA

*Het adaptergebruik kan worden aangepast op basis van verschillende soorten totaal RNA-monsters en de invoerhoeveelheid.

Bibliotheekversterking

Amplificatiecyclusnummers moeten strikt worden gecontroleerd. Onvoldoende amplificatie kan leiden tot een lage bibliotheekopbrengst; Overamplificatie kan leiden tot verhoogde bias, fouten, gedupliceerde read en chimere producten. Tabel 2 geeft aanbevolen cyclusnummers weer die gericht zijn op een bibliotheekopbrengst van 1 μg.

Tafel 2 Het aanbevolen aantal cycli om een ​​DNA- en RNA-bibliotheek te genereren *

Opmerking: *De opbrengst van de bibliotheek is niet alleen gerelateerd aan de invoerhoeveelheid en het aantal amplificatiecycli, maar wordt ook beïnvloed door de kwaliteit van de monsters, fragmentatieomstandigheden en sorteeromstandigheden. Kies tijdens het proces van bibliotheekconstructie de meest geschikte omstandigheden op basis van de werkelijke situatie.

Op kralen gebaseerde DNA-opruiming en grootteselectie

1. 1. Er zijn meerdere stappen in het bibliotheekconstructieproces die DNA-zuiveringsmagnetische kralen vereisen. Wij raden Hieff NGS™ DNA Selection Beads aan (Yeasen Cat#12601) of AMPure® XP magnetische kralen (Beckman Cat#A63880) voor DNA-zuivering en grootteselectie.
2. 2. De magnetische kralen moeten voor gebruik op kamertemperatuur worden gebracht, anders neemt de opbrengst af en wordt het effect van de grootteselectie beïnvloed.
3. 3. De magnetische kralen moeten vóór gebruik goed worden gemengd door middel van vortexen of pipetteren.
4. 4. Zuig de kralen niet op bij het overbrengen van de supernatant, zelfs sporen van de kralen kunnen de volgende reacties beïnvloeden.
5. 5. De 80% ethanol moet vers worden bereid, anders heeft dit invloed op de winningsefficiëntie.
6. 6. De magnetische kralen moeten bij kamertemperatuur worden gedroogd voordat het product wordt geëlueerd. Onvoldoende droogte zal er gemakkelijk voor zorgen dat ethanolresten de daaropvolgende reacties beïnvloeden; overmatige droogte zal ervoor zorgen dat de magnetische kralen barsten en de zuiveringsopbrengst verminderen. Normaal gesproken is drogen bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten voldoende om de kralen volledig te laten drogen.
7. 7. Indien nodig worden de gezuiverde of op grootte geselecteerde DNA-monsters geëlueerd in1× TE-buffer kan 1-2 weken bewaard worden bij 4°C of een maand bij -20°C.

Analyse van de bibliotheekkwaliteit

1. De kwaliteit van de geconstrueerde bibliotheken wordt doorgaans geanalyseerd door de concentraties en grootteverdelingen te meten.
2. De concentraties in bibliotheken kunnen worden gemeten met behulp van op fluorescentie gebaseerde methoden zoals Qubit en PicoGreen of qPCR.
3. Het wordt NIET aanbevolen om op absorptie gebaseerde kwantificeringsmethoden zoals NanoDrop te gebruiken.
4. Het wordt aanbevolen om de qPCR-methode te gebruiken voor bibliotheekkwantificering: fluorescentiegebaseerde methoden zoals Qubit en PicoGreen kunnen de incomplete dsDNA-structuren (inserts zonder adapter of met slechts één van de uiteinden geligeerd met adapter) niet onderscheiden van de complete bibliotheken. De qPCR-methode zal alleen de complete bibliotheken met beide uiteinden geligeerd met adapters (de sequenceerbare bibliotheken) amplificeren en meten, waardoor een nauwkeurigere meting voor het laden wordt geboden.
5. De grootteverdeling van bibliotheken kan worden geanalyseerd met Agilent Bioanalyzer of andere apparaten die gebaseerd zijn op de principes van capillaire elektroforese of microfluïdica.

Andere materialen

1. 1. Magnetische DNA-zuiveringskorrels: Hieff NGS™ DNA-selectiekorrels (Yeasen Cat#12601) of AMPure^®XP Beads (A63880) of andere gelijkwaardige producten.

2.Adapters: Complete adapter voor Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 of andere gelijkwaardige producten) of Complete Adapter voor MGI (Yeasen Cat#13360-13362 of andere gelijkwaardige producten).

3. Kwaliteitsanalyse van de bibliotheek: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip of andere gelijkwaardige producten; kwantitatieve reagentia voor de bibliotheek.
4. Overige materialen: absolute ethanol, steriel ultrapuur water, pipetpunten met lage retentie, PCR-buis, magnetische standaards, thermocycler, enz.

Documenten:

Handleidingen

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Bibliotheek Co-Prep Kit V2.pdf