Beschrijving
Productomschrijving
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit is een totale RNA-sequencingbibliotheekconstructiekit voor het Illumina®- en MGI®-sequencingplatform, inclusief RNA-fragmentatiereagentia, reverse transcriptiereagentia, conventionele en strengspecifieke ds-cDNA-synthesereagentia en bibliotheekamplificatiereagentia. De sequentiebibliotheek kan worden geconstrueerd gevolgd door de mRNA-zuiveringskit of rRNA-verwijderingskit. De tweestrengssynthesemodule is uitgerust met twee buffers om te voldoen aan de behoefte aan een conventionele bibliotheek of strengspecifieke bibliotheek. Daaronder wordt dTTP vervangen door dUTP in de strengspecifieke tweestrengssynthesebuffer, zodat dUTP kan worden toegevoegd aan de tweede streng cDNA. De high-fidelity DNA-polymerase die in deze kit wordt gebruikt, kan de DNA-template met uracil niet amplificeren, waardoor strengspecificiteit wordt bereikt. Alle geleverde reagentia hebben een strenge kwaliteitscontrole en functionele verificatie ondergaan, waardoor de stabiliteit en reproduceerbaarheid van de bibliotheekconstructie in de grootste mate worden gegarandeerd.
Werkstroom
Productcomponenten
| Componenten | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | 2× Frag/Prime-buffer | 250 μL | 930 μL | ||
| 12308-B | 1e streng enzymmix | 48 μL | 192 μL | ||
| 12308-C | Strengspecificiteitsreagens | 150 μL | 580 μL | ||
| 12308-D | 2e strengbuffer (dNTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-E | 2e strengbuffer (dUTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-F | 2e streng enzym mastermix | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-G | Ligatieversterker | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-H | Nieuwe T4 DNA-ligase | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-ik | 2×Super Canace® II High-Fidelity-mix | 600 μL | 2×1200 μL | ||
| 12308-K | Nuclease-vrij H2O | 300 μL | 1000 μL | ||
Let op: Deze kit is compatibel met zowel Illumina- als MGI-platforms, maar extra Illumina of MGI Primermix (Cat.nr. 13335 Primermix voor Illumina en Cat# 13334 Primer Mix voor MGI ) is vereist.
Verzending en opslag
De componenten van de Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit in doos I worden geleverd met koelelementen en kunnen een jaar lang bij 2-8°C worden bewaard.
De componenten van de Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit in doos II worden verzonden met droogijs en kunnen een jaar lang bij -20°C worden bewaard.
Voorzorgsmaatregelen
1 Bediening
1.1 Draag voor uw veiligheid en gezondheid persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals laboratoriumjassen en wegwerphandschoenen, wanneer u met dit product werkt. Dit product is ALLEEN bedoeld voor onderzoeksdoeleinden!
1.2 Ontdooi de componenten op kamertemperatuur. Meng grondig door ze meerdere keren op en neer te draaien, draai ze kort en zet ze op ijs voor gebruik.
1.3 Het wordt aanbevolen om elke stapreactie uit te voeren in een thermocycler met een verwarmd deksel. De thermocycler moet voor gebruik worden voorverwarmd tot de ingestelde temperatuur.
1.4 Er zijn benodigdheden nodig die vrij zijn van RNase-verontreiniging en het is noodzakelijk om het experimentele gebied regelmatig te reinigen.
1.5 Onjuiste handelingen kunnen zeer waarschijnlijk aerosolverontreinigingen veroorzaken, wat de nauwkeurigheid van het resultaat beïnvloedt. Verplichte fysieke isolatie van PCR-reactiemenggebieden en PCR-productzuiveringsassaygebieden wordt aanbevolen. Uitgerust met apparatuur zoals gespecialiseerde pipetten voor bibliotheekconstructie.
2 Adapterligatie
2.1 Illumina of MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kits en korte adapter kits zijn beschikbaar waaruit klanten kunnen kiezen op basis van hun experimentele vereisten.
2.2 Het selecteren van hoogwaardige, commerciële adapters werd aanbevolen. Als zelfgemaakte adapters worden geselecteerd, vertrouw dan een bedrijf toe met ervaring in NGS-primersynthese en merk op dat er strikte contaminatiecontrole nodig is. Daarnaast wordt aanbevolen om DNA-annealingoplossing te bereiden in een schone werkbank en slechts één type adapter per keer te gebruiken om kruisbesmetting te voorkomen.
2.3 Laat de adapters ontdooien op ijs of bij 4°C. Bij gebruik op kamertemperatuur mag de laboratoriumtemperatuur niet hoger zijn dan 25°C om te voorkomen dat de adapters denatureren.
2.4 De concentratie van de adapter heeft direct invloed op de ligatie-efficiëntie en de opbrengst van de bibliotheek. Het adaptervolume dat aan de kit wordt toegevoegd, is vastgesteld op 5 μl. Het wordt aanbevolen om de adapters te verdunnen met 0,1×TE-buffer en de verdunde adapters kunnen 48 uur bij 4°C worden bewaard. In tabel 1 staat de aanbevolen adapterhoeveelheid voor verschillende hoeveelheden input-RNA.
Tabel 1-1 De aanbevolen Illumina-adapterhoeveelheid voor verschillende invoer-RNA
| Invoer totaal RNA | Verlicht Adapter voorraadconcentratie |
| 10 gram | 1 μM |
| 100 gram | 1,5 μM |
| 500 gram | 3 μM |
| ≥1 μg | 5 μM |
Tabel 1-2 De aanbevolen MGI®-adapterhoeveelheid voor verschillende input-RNA
| Invoer totaal RNA | MGI Adapter voorraadconcentratie |
| 100-499 ng | 2 μM |
| 500-4000 ng | 5 μM |
*Het adaptergebruik kan worden aangepast op basis van verschillende soorten totaal RNA-monsters en de invoerhoeveelheid.
3 Bibliotheekversterking
3.1 Op basis van de DNA-polymerase van de eerste generatie heeft de hoogwaardige DNA-polymerase in de kit de uniformiteit van de amplificatie aanzienlijk verbeterd en vertoont geen amplificatiebias.
3.2 Als een geïndexeerde adapter (ook bekend als een lange adapter of grote Y-adapter) aan het doel-DNA wordt geligeerd, kan de primermix die in deze kit wordt geleverd, worden gebruikt voor amplificatie. Als een "korte adapter" of "kleine Y-adapter" wordt gebruikt voor DNA-ligatie, zijn indexprimers nodig voor amplificatie.
3.3 Amplificatiecyclusnummers moeten strikt worden gecontroleerd. Onvoldoende amplificatie kan leiden tot een lage bibliotheekopbrengst; Overamplificatie kan leiden tot verhoogde bias, fouten, gedupliceerde read, chimere producten en accumulatie van expansiemutaties. Tabel 2 geeft de aanbevolen cyclusnummers voor PCR-amplificatie.
Tabel 2 Het aanbevolen aantal cycli om een RNA-bibliotheek te genereren*
| Invoer totaal RNA | Aantal cycli | |
| Niet-gestrand | Gestrand | |
| 10 gram | 15 | 15 |
| 100 gram | 14 | 14 |
| 500 gram | 12 | 13 |
| 1 μg | 11 | 12 |
Let op: *De opbrengst van de bibliotheek is niet alleen gerelateerd aan de invoerhoeveelheid en het aantal versterkingscycli maar ook beïnvloed door de kwaliteit van de monsters, fragmentatiecondities en sorteercondities. Kies in het proces van bibliotheekconstructie de meest geschikte condities op basis van de werkelijke situatie.
4 DNA-opruiming en maatselectie op basis van kralen
4.1 Er zijn meerdere stappen in het bibliotheekconstructieproces waarvoor magnetische kralen voor DNA-zuivering nodig zijn. Wij raden Hieff NGS™ DNA Selection Beads aan (
4.2 De magnetische kralen moeten voor gebruik op kamertemperatuur worden gebracht, anders neemt de opbrengst af en wordt het grootte-selectieve effect beïnvloed.
4.3 De magnetische kralen moeten vóór gebruik goed worden gemengd door middel van vortexen of pipetteren.
4.4 Zuig de kralen niet op bij het overbrengen van de supernatant, zelfs sporen van de kralen kunnen de volgende reacties beïnvloeden.
4.5 De 80% ethanol moet vers worden bereid, anders heeft dit invloed op de winningsefficiëntie.
4.6 De magnetische kralen moeten bij kamertemperatuur worden gedroogd voordat het product wordt geëlueerd. Onvoldoende droogte zal er gemakkelijk voor zorgen dat ethanolresten de daaropvolgende reacties beïnvloeden; overmatige droogte zal ervoor zorgen dat de magnetische kralen barsten en de zuiveringsopbrengst verminderen. Normaal gesproken is drogen bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten voldoende om de kralen volledig te laten drogen.
4.7 Indien nodig kunnen de gezuiverde of op grootte geselecteerde DNA-monsters die in TE-buffer zijn geëlueerd, gedurende 1-2 weken bij 4°C of gedurende een maand bij -20°C worden bewaard.
5 Analyse van de bibliotheekkwaliteit
5.1 Normaal gesproken kan de kwaliteit van de geconstrueerde bibliotheek worden geëvalueerd door middel van lengteverdeling en concentratiedetectie.
5.2 Detectie van bibliotheekconcentratie: methoden gebaseerd op dubbelstrengs DNA-fluorescentiekleurstoffen, zoals Qubit®, PicoGreen®, enz.; absolute kwantificering gebaseerd op qPCR.
5.3 Methoden gebaseerd op spectrale detectie, zoals NanoDrop®, etc., zijn niet toepasbaar voor bibliotheekconcentratiedetectie.
5.4 qPCR wordt aanbevolen voor bibliotheekconcentratiedetectie: Via Qubit®, PicoGreen® en andere methoden op basis van dubbelstrengs DNA-fluorescerende kleurstoffen kan het geen effectief onderscheid maken tussen producten die aan één uiteinde aan adapters zijn geligeerd, producten die aan beide uiteinden niet aan adapters zijn geligeerd en andere onvolledige dubbelstrengsproducten. Absolute kwantificering van qPCR is gebaseerd op het principe van PCR-amplificatie, dat alleen de volledige bibliotheek van de adapter aan beide uiteinden van het monster kwantificeert (de bibliotheek die kan worden gesequenced), met uitsluiting van de interferentie van niet-sequencingbibliotheken die niet aan de adapter zijn geligeerd aan zowel single-ended als double-ended uiteinden.
5.5 De detectie van de lengteverdeling van de bibliotheek kan worden uitgevoerd met Agilent Bioanalyzer 2100 en andere apparatuur op basis van het principe van capillaire elektroforese of microfluïdica.
Documenten:
12308ES-Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit-Ver.EN20230327.pdf
Citaten en referenties:
[1] Ontcijferen van het darmmicrobioom van graskarpers door middel van een multi-omics-benadering
M Li, H Liang, H Yang, Q Ding, R Xia, J Chen, W Zhou… - Microbioom, 2024 IF:19.4
[2] Gepoolde CRISPR-screening identificeert P-lichamen als repressoren van de epitheliale-mesenchymale transitie van kanker
L Fang, L Zhang, M Wang, Y He, J Yang, Z Huang… - Kankeronderzoek, 2024 IF:12.7
[3] Klotho-afgeleid peptide 1 remt cellulaire veroudering in de fibrotische nier door de Klotho-expressie te herstellen via posttranscriptionele regulatie
X Zhang, L Li, H Tan, X Hong, Q Yuan, FF Hou… - Theranostics, 2024 IF:12.4
[4] Exoskelet gedeeltelijk gecoate stamcellen voor herstel van geïnfarcteerde myocard
H He, Y Yuan, Y Wu, J Lu, X Yang, K Lu… - Geavanceerde materialen, 2023 IF: 29,4
[5] Genomische innovatie en regelgevende herinrichting tijdens de evolutie van het katoengeslacht Gossypium
M Wang, J Li, Z Qi, Y Long, L Pei, X Huang… - Nature Genetics, 2022 IF:41.379
[6] MTMR3-risicoallelen versterken de door Toll Like Receptor 9 geïnduceerde IgA-immuniteit bij IgA-nefropathie
Y Wang, T Gan, S Qu, L Xu, Y Hu, L Liu, S Shi, J Lv… - Kidney International, 2023 IF:19.6
[7] Gesplitste aanvulling van basiseditors om off-target-bewerkingen te minimaliseren
X Xiong, K Liu, Z Li, FN Xia, XM Ruan, X He, JF Li - Natuurplanten, 2023 IF:18.6
[8] Geconstrueerde bacteriële buitenmembraanvesikels die oncolytische adenovirussen inkapselen, verbeteren de werkzaamheid van kankervirotherapie door de autofagie van tumorcellen te vergroten
W Ban, M Zon, H Huang, W Huang, S Pan… - Nature Communications, 2023 IF:16.6
[9] Kankercelresistentie tegen IFNγ kan optreden via verbeterde activiteit van het dubbelstrengsbreukherstelpad
T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - Kankerimmunologieonderzoek, 2023 IF: 12.0
[10] Combinatietherapie gebaseerd op een biomimetisch nano-afgiftesysteem met twee doelen voor het overwinnen van cisplatineresistentie bij hepatocellulair carcinoom
Y Huang, Q Kou, Y Su, L Lu, X Li, H Jiang… - Journal of Nanobiotechnology, 2023 IF: 10,9
[11] PIAS3 bevordert ferroptose door TXNIP te reguleren via het TGF-β-signaalpad bij hepatocellulair carcinoom
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - Farmacologisch onderzoek, 2023 IF:9.3
[12] Identificatie van RNA-bindende eiwitdoelen met HyperTRIBE in Saccharomyces cerevisiae
W Piao, C Li, P Sun, M Yang, Y Ding, W Song… - International Journal of Molecular Science, 2023 IF:5.6
[13] Microbiota reguleert de levenscyclusovergang en de dynamiek van nematocyten bij kwallen
S Peng, L Ye, Y Li, F Wang, T Sun, L Wang, W Hao… - Iscience, 2023 IF: 5.08
[14] Transcriptoom- en miRNA-profielen onthullen regulerend netwerk en belangrijkste regulatoren van secundaire xyleemvorming in “84K”-populier
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - Internationaal tijdschrift voor moleculaire wetenschap, 2023 IF:5.6
Betaling en beveiliging
Uw betalingsinformatie wordt veilig verwerkt. We slaan geen creditcardgegevens op en hebben geen toegang tot uw creditcardinformatie.
Navraag
Misschien vind je het ook leuk
FAQ
Het product is alleen bedoeld voor onderzoeksdoeleinden en is niet bedoeld voor therapeutisch of diagnostisch gebruik bij mensen of dieren. Producten en inhoud worden beschermd door patenten, handelsmerken en auteursrechten die eigendom zijn van
Voor bepaalde toepassingen zijn mogelijk aanvullende intellectuele eigendomsrechten van derden vereist.