Hoog NGS™ One Pot Flash DNA Library PrepKit is een snelle enzymatische DNA-bibliotheekkit，heks bevat hoogwaardige enzymen voor DNA-fragmentatie en combineert DNA-fragmentatie, eindreparatie en dA-tailing in één stap, wat de tijd en kosten van bibliotheekvoorbereiding aanzienlijk verkort.

Deze bibliotheekvoorbereidingskit is compatibel met 100 pg-500 ng monsters van alle veelvoorkomende dieren, planten, micro-organismen, enz.

en realiseer snel DNA-fragmentatie, terminale reparatie en A-staartadditiereactie in één enkele buis. De kit moet worden gecombineerd met adapters en primers en is compatibel met Illumina en MGI sequentieplatforms met hoge doorvoer.

Functie

1) Geschikt voor genomische DNA-monsters van 100 pg-500 ng.

2）compatibel met Illumina en MGI sequentieplatforms met hoge doorvoer.

3）Fragmentatie, eindreparatie en A-tailing reactie binnen 5 minuten

4）Efficiënte conversiesnelheid van bibliotheken en versterkingsefficiëntie.

Specificaties

Componenten

Opmerking: * geeft aan dat dit reagens niet in deze kit is inbegrepen en dat er extra reagentia nodig zijn.De kit is compatibel met twee platforms van Illumina en MGI, maar extra primermix (CAT # 13334 Primer Mix voor MGI en Cat# 13335 Primer Mix voor Illumina) is vereist.

Opslag

Dit product moet worden bewaard bij -25~-15℃ voor 1 jaar.

Cijfers

Figuur 1. Detectie van DNA van 10 soorten micro-organismen

Bibliotheken werden voorbereid met behulp van Cat#12316 protocol ,10 ng de ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard (Zymo Research® #D6306). Bibliotheken werden samengevoegd en gesequenced op een Illumina (SE75).De sequentiegegevens werden gehomogeniseerd tot 20M en vergeleken over verwachte en gedetecteerde samenstelling voor beide invoerniveaus. De detectie van specifieke microbiële gDNA was consistent met de verwachte samenstelling. Verwachte samenstelling: Cryptococcus neoformans 2%, Saccharomyces cerevisiae 2%, Bacillus subtilis 12%, Escherichia coli 12%, Enterococcus faecalis 12%, Lactobacillus fermentum 12%, Listeria monocytogenes 12%, Pseudomonas aeruginosa 12%, Staphylococcus aureus 12% en Salmonella enterica 12%.

Over de operatie

1. Werk met labjassen en wegwerphandschoenen，voor uw veiligheid.

2. Laat de componenten ontdooien op kamertemperatuur. Na ontdooien, meng grondig door te vortexen, draai de buis kort rond en zet ze op ijs voor later gebruik.

3. Bij het bereiden van de reactieoplossing in elke stap, wordt aanbevolen om een ​​pipet te gebruiken om gelijkmatig te blazen en te mengen of voorzichtig te schudden. Hevig schudden kan ervoor zorgen dat de bibliotheekuitvoer afneemt.

4. Om kruisbesmetting van monsters te voorkomen, wordt aanbevolen om een ​​pistoolkop met een filterelement te gebruiken. Vervang de pistoolkop bij het absorberen van verschillende monsters.

5. Het wordt aanbevolen om elke reactiestap uit te voeren in een thermocycler met een verwarmd deksel. De thermocycler moet voor gebruik worden voorverwarmd tot de ingestelde temperatuur.

6. Onjuiste handelingen kunnen zeer waarschijnlijk aerosolverontreinigingen veroorzaken, wat de nauwkeurigheid van het resultaat beïnvloedt. Verplichte fysieke isolatie van PCR-reactiemenggebieden en PCR-productzuiveringsassaygebieden wordt aanbevolen. Uitgerust met apparatuur zoals gespecialiseerde pipetten voor bibliotheekconstructie.

7. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.

Over DNA-fragmentatie

1. Het compatibele bereik van deze kit is 100 pg–500 ng input DNA. Hoogwaardige input DNA met A260/A280 = 1.8-2.0 moet zoveel mogelijk worden gebruikt.

2. Als het Input DNA een hoge concentratie metaalionenchelerend middel of andere zouten bevat, kan dit de daaropvolgende experimenten beïnvloeden. Het wordt aanbevolen om het DNA te verdunnen in ddH2O of Tebuffer (10 mm tris-HCl, pH 8,0-8,5; 0,1 mM EDTA).

3. Voor de meeste hoogwaardige genomische DNA wordt de verteringstijd weergegeven in Tabel 1. De kit heeft een lage voorkeur en kan verschillende sjablonen met GC-inhoud tolereren.

Tabel 1. Aanbevolen tijd voor conventionele genomische DNA-fragmentatie

Adapter Ligatie

1. De concentratie van de adapter heeft direct invloed op de ligatie-efficiëntie en de opbrengst van de bibliotheek. Overmatig gebruik van Adapter kan meer adapterdimeer produceren; een lage dosering kan de ligatie efficiëntie en bibliotheekopbrengst. Tabellen 2 en 3 geven de aanbevolen hoeveelheid van Adapter voor verschillende Input DNA-inputs met behulp van deze kit.

Tabel 2. De aanbevolen Illumina adapterbedrag voor verschillende invoer-DNA

Tabel 3. De aanbevolen MGI adapterbedrag voor verschillende invoer-DNA

Bibliotheekversterking

Amplificatiecyclusnummers moeten strikt worden gecontroleerd. Onvoldoende amplificatie kan leiden tot een lage bibliotheekopbrengst; Overamplificatie kan leiden tot verhoogde bias, fouten, gedupliceerde read en chimere producten. Tabel 4 geeft aanbevolen cyclusnummers weer die gericht zijn op de bibliotheekopbrengst van 1 μG.

Tabel 4. De aanbevolen cycli van 100 pg-500 ng Input DNA

Op kralen gebaseerde DNA-opruiming en grootteselectie

1. Er zijn meerdere stappen in het bibliotheekconstructieproces die DNA-zuiveringsmagnetische kralen vereisen. Wij raden Hieff NGS aan™ DNA-selectiekralen (Yeasen Cat#12601) of AMPure™ Magnetische XP-korrels (Beckman Cat#A63880) voor DNA-zuivering en grootteselectie.

2. De magnetische kralen moeten voor gebruik op kamertemperatuur worden gebracht, anders neemt de opbrengst af en wordt het effect van de grootteselectie beïnvloed.

3. De magnetische kralen moeten vóór gebruik goed worden gemengd door middel van vortexen of pipetteren.

4. Zuig de kralen niet op bij het overbrengen van de supernatant, zelfs sporen van de kralen kunnen de volgende reacties beïnvloeden.

5. De 80% ethanol moet vers worden bereid, anders heeft dit invloed op de winningsefficiëntie.

6. De magnetische kralen moeten bij kamertemperatuur worden gedroogd voordat het product wordt geëlueerd. Onvoldoende droogte zal er gemakkelijk voor zorgen dat ethanolresten de daaropvolgende reacties beïnvloeden; overmatige droogte zal ervoor zorgen dat de magnetische kralen barsten en de zuiveringsopbrengst verminderen. Normaal gesproken is drogen bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten voldoende om de kralen volledig te laten drogen.

7. Indien nodig worden de gezuiverde of op grootte geselecteerde DNA-monsters geëlueerd in 0.1× TE-buffer kan 1-2 weken bewaard worden bij 4°C of een maand bij -20°C.

Analyse van de bibliotheekkwaliteit

1. De kwaliteit van de geconstrueerde bibliotheken wordt over het algemeen geanalyseerd door de concentraties en grootteverdelingen te meten.

2. De concentraties in bibliotheken kunnen worden gemeten met behulp van op fluorescentie gebaseerde methoden zoals Qubit en PicoGreen of qPCR.

3. Het wordt afgeraden om op absorptie gebaseerde kwantificeringsmethoden zoals NanoDrop te gebruiken.

4. Het wordt aanbevolen om de qPCR-methode te gebruiken voor bibliotheekkwantificering: fluorescentiegebaseerde methoden zoals Qubit en PicoGreen kunnen de incomplete dsDNA-structuren (inserts zonder adapter of met slechts één van de uiteinden geligeerd met adapter) niet onderscheiden van de complete bibliotheken. De qPCR-methode zal alleen de complete bibliotheken met beide uiteinden geligeerd met adapters (de sequentiële bibliotheken) amplificeren en meten, waardoor een nauwkeurigere meting voor het laden wordt geboden.

5. De grootteverdeling van bibliotheken kan worden geanalyseerd met behulp van Agilent Bioanalyzer of andere apparaten die gebaseerd zijn op de principes van capillaire elektroforese of microfluïdica.

Documenten:

Veiligheidsinformatieblad

12316_MSDS_HB250211_NL.PDF

Handleidingen

12316_Handleiding_Ver.EN20241225.pdf