Hoog NGS^TM EvoMax RNA Library Prep Kit (dUTP) is een voorgemengd, actinomycine D vrij en streng-specifiek totaal RNA-sequentiebibliotheek voorbereiden kit compatibel met Illumina en MGI platforms. Dit product is beschikbaar in twee types: buis of afdichtingskit, en Deze kit is meer handig hetzij door een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsapparaat of handmatige manipulatie De kit bevat RNA-fragmentatiereagentia, reverse transcriptiereagentia, strengspecifieke ds-cDNA-synthesereagentia en bibliotheekamplificatiereagentia. Het kan worden gekoppeld aan de mRNA-zuiveringskit of de rRNA-verwijderingskit om mRNA- of lncRNA-onderzoek doen. Dit product optimaliseert de reverse transcriptiemodule om een ​​bibliotheek met hoge ketenspecificiteit te verkrijgen zonder actinomycine D, wat de veiligheid van de experimentatoren in grotere mate waarborgt. Alle reagentia werden onderworpen aan strikte kwaliteitscontrole en functionele validatie om de stabiliteit en herhaalbaarheid van de bibliotheek te maximaliseren voorbereiding.

Specificaties

Componenten

Let op: * De notatie geeft aan dat het onderdeel niet in de kit is inbegrepen. Primermix is ​​vereist als de complete adapters worden gebruikt, anders is het niet't. Deze kit is compatibel met Illumina- en MGI-platforms, maar heeft een extra primermix nodig (Cat.nr. 13334 Primer Mix voor MGI^TM en Cat # 13335 Primer Mix voor Illumina®) voor Illumina® of MGI-platform als de complete adapters worden gebruikt.

Figuur

De indeling van de plaatreagensgroep.

Figuur 1: reagensindeling van de bibliotheekkit met afsluitplaten

Figuur 2. Vereenvoudigde componenten van EvoMax RNA-bibliotheekvoorbereidingskit.

Opslag

Dit product moet worden bewaard bij -25~-15℃ gedurende 1 jaren.

Instructies

1. De aanbevolen hoeveelheid om toe te voegen aan een systeem van 20 μL is 0,1-1 eenheden (U), en de invoerhoeveelheid kan worden aangepast op basis van de werkelijke resultaten.

2. Afhankelijk van de eisen van het experiment kan de uiteindelijke concentratie dUTP worden aangepast tussen 0,2 en 0,6 mM, en kan selectief 0,2 mM dTTP worden toegevoegd.

3. De reactietijd bij 25~37℃ Kan binnen 5~10 min. worden aangepast, afhankelijk van de experimentele vereisten.

Notities

1. Bediening

1) Werk alstublieft met labjassen en wegwerphandschoenen，voor uw veiligheid.

2) Ontdooi componenten op kamertemperatuur. Meng grondig door meerdere keren op en neer te keren, draai kort naar beneden en plaats op ijs voor gebruik.

3) Het wordt aanbevolen om elke stapreactie uit te voeren in een thermocycler met een verwarmd deksel. De thermocycler moet voor gebruik worden voorverwarmd tot de ingestelde temperatuur.

4) Voorraden vrij van RNase-verontreiniging en regelmatige reiniging van het experimentele gebied zijn noodzakelijk. ThermoFisher's RNAZap^TM Er werd een spray met een hoge efficiëntie voor het verwijderen van nucleïnezuur aanbevolen om RNase-verontreiniging te verwijderen.

5) Onjuiste handelingen kunnen zeer waarschijnlijk aerosolverontreinigingen veroorzaken, wat de nauwkeurigheid van het resultaat beïnvloedt. Verplichte fysieke isolatie van PCR-reactiemenggebieden en PCR-productzuiveringsassaygebieden wordt aanbevolen. Uitgerust met apparatuur zoals speciale pipetten voor de bouw van bibliotheken.

6) Dit reagens is voor eenmalig gebruik. Meervoudig gebruik is strikt verboden.

7) Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.

2. Adapterligatie

1) Klanten kunnen kiezen uit Illumina of MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kits en korte Adapter kits, afhankelijk van hun experimentele vereisten.

2) Het werd aanbevolen om hoogwaardige, commerciële adapters te selecteren. Als u zelfgemaakte adapters selecteert, vertrouw dan een bedrijf toe met ervaring in NGS-primersynthese en merk op dat er strikte contaminatiecontrole nodig is. Daarnaast wordt aanbevolen om DNA-annealingoplossing te bereiden in een schone werkbank en slechts één type adapter per keer te gebruiken om kruisbesmetting te voorkomen.

3) Laat de adapters ontdooien op ijs of bij 4°C. Bij gebruik op kamertemperatuur mag de laboratoriumtemperatuur niet hoger zijn dan 25°C om te voorkomen dat de adapters denatureren.

4) De concentratie van de adapter heeft rechtstreeks invloed op de ligatie-efficiëntie en de bibliotheekopbrengst. Het adaptervolume dat aan de kit wordt toegevoegd, is vastgesteld op 5 μl. Het wordt aanbevolen om de adapters te verdunnen met 0,1×TE-buffer en de verdunde adapters kunnen 48 uur bij 4°C worden bewaard. Tabel 1 geeft de aanbevolen adapterhoeveelheid weer voor verschillende hoeveelheden invoer-RNA.

Tabel 1-1 De aanbevolen Illumina-adapterhoeveelheid voor verschillende invoer-RNA

Tabel 1-2 De aanbevolen MGI-adapterhoeveelheid voor verschillende input-RNA

* Het adaptergebruik kan worden aangepast op basis van verschillende soorten totale RNA-monsters en de invoerhoeveelheid

3.Bibliotheekversterking

1) Op basis van de DNA-polymerase van de eerste generatie heeft de hoogwaardige DNA-polymerase in de kit de uniformiteit van de amplificatie aanzienlijk verbeterd en vertoont geen amplificatiebias.

2) Amplificatiecyclusnummers moeten strikt worden gecontroleerd. Onvoldoende amplificatie kan leiden tot een lage bibliotheekopbrengst; Overamplificatie kan leiden tot verhoogde bias, fouten, gedupliceerde read, chimere producten en accumulatie van expansiemutaties. In tabel 2 staan ​​de aanbevolen cyclusnummers voor PCR-amplificatie.

3) Het aanbevolen aantal cycli in Tabel 2 kan voldoen aan de overgrote meerderheid van de vereisten voor bibliotheekvoorbereiding. Als uw monster van slechte kwaliteit is (zoals FFPE-monsters met ernstige degradatie), kan het aantal cycli op passende wijze worden verhoogd, afhankelijk van de werkelijke situatie. Let op: mRNA verschilt per soort en weefsel, het aantal amplificatiecycli moet worden aangepast.

Tabel 2 Invoer Totaal RNA-volume en aanbevolen amplificatiecycli Tabel *

[Opmerking]: *De opbrengst van de bibliotheek is niet alleen gerelateerd aan de invoerhoeveelheid en het aantal amplificatiecycli, maar wordt ook beïnvloed door de kwaliteit van de monsters, fragmentatieomstandigheden en sorteeromstandigheden. Kies tijdens het proces van bibliotheekconstructie de meest geschikte omstandigheden op basis van de werkelijke situatie.

4. Op kralen gebaseerde DNA-opruiming en selectie van de grootte

1) Er zijn meerdere stappen in het bibliotheekconstructieproces die DNA-zuiveringsmagnetische kralen vereisen. Wij raden Hieff NGS™ DNA Selection Beads aan (Yeasen Cat#12601) of AMPure® XP magnetische kralen (Beckman Cat#A63880) voor DNA-zuivering en grootteselectie.

2) De magnetische kraal moet voor gebruik op kamertemperatuur worden gebracht, anders De opbrengst zal afnemen en het effect van de grootteselectie zal worden beïnvloed.

3) De magnetische kralen moeten vóór gebruik goed worden gemengd door middel van vortexen of pipetteren.

4) Zuig de kralen niet op bij het overbrengen van de supernatant, zelfs sporen van de kralen kunnen de volgende reacties beïnvloeden.

5) De 80% ethanol moet vers worden bereid, anders heeft dit invloed op de winningsefficiëntie.

6) De magnetische kralen moeten bij kamertemperatuur worden gedroogd voordat het product wordt geëlueerd. Onvoldoende droogte zal er gemakkelijk voor zorgen dat ethanolresten de daaropvolgende reacties beïnvloeden; overmatige droogte zal ervoor zorgen dat de magnetische kralen barsten en de zuiveringsopbrengst verminderen. Normaal gesproken is drogen bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten voldoende om de kralen volledig te laten drogen.

7) Indien nodig kunnen de gezuiverde of op grootte geselecteerde DNA-monsters die in TE-buffer zijn geëlueerd, gedurende 1-2 weken bij 4°C of gedurende een maand bij -20°C worden bewaard.

5.Analyse van de bibliotheekkwaliteit

Over het algemeen kan de kwaliteit van de geconstrueerde bibliotheek worden geëvalueerd door middel van concentratiedetectie en lengteverdelingsdetectie.

6. Overig materiaal

1) mRNA-verrijkingskit: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat.nr. 12629).

2) rRNA-verwijderingskit: Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS / ETS) (Yeasen Cat.nr. 12257) of een andere rRNA-verwijderingskit.

3) RNA-zuivering van magnetische kralen: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat.nr. 12602) of andere gelijkwaardige producten.

4) DNA-gezuiverde magnetische kralen: Hieff NGS® DNA-selectiekralen (Yeasen Cat.nr. 12601) of AMPure® XP Beads (A63880) of andere gelijkwaardige producten.

5) RNA-kwaliteitscontrole: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip of andere gelijkwaardige producten.

6) Adapters: Complete adapter voor Illumina®-gebruik (Cat.nr. 13519-13520 of ander equivalent) of complete adapter voor MGI®-gebruik (Cat.nr. 13360-13362 of ander equivalent).

7. Kwaliteitsinspectie van de bibliotheek

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / High Sensitivity Chip of andere gelijkwaardige producten; bibliotheekkwantificeringsreagentia.

8. Overige materialen

Watervrije ethanol, steriel ultrapuur water, pistoolkop met lage adsorptie, PCR-buis, magnetisch frame, PCR-instrument, enz.

Stroomdiagram

Figuur 1: RNA-bibliotheekopbouwproces

RNA-bibliotheekvoorbereiding voor FFPE-monsters van verschillende kwaliteit

Voor ernstig afgebroken FFPE-RNA (DV 200 <50%) en monsters met een lage invoer adviseren wij een protocol voor dubbele zuivering na adapterligatie om bibliotheekverlies te beperken.

Piekpatronen van FFPE-monsters van verschillende kwaliteit