Globine mRNA-uitputtingssonde (menselijk) is ontworpen om menselijk Globin mRNA te verwijderen. Het kan effectief Globin mRNA verwijderen van volwassenen, baby's en embryo'sleuk bronnen, waaronder HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 en HBZ. Dit product wordt gebruikt met Hieff NGS^TM MaxUp rRNA-uitputtingskit (mens/muis/rat) (Yeasen#12253) om effectief rRNA en Globin mRNA uit totaal RNA te verwijderen. Deze kit is geschikt voor zowel intacte als afgebroken RNA-monsters. De RNA-monsters na verwijdering van rRNA & Globin mRNA kunnen worden gebruikt voor high-throughput sequencing-analyse van mRNA en niet-coderende RNA, wat het aandeel van geldige gegevens in sequentieresultaten aanzienlijk verbetert, en cDNA-synthese of andere downstream-toepassingen.

Producttoepassing

Geschikt voor 100 ng~1 μg totaal RNA-monsters van mensen, bloedbron van muizen en ratten, en voor zowel intacte als gedeeltelijk afgebroken RNA-monsters.

Productcomponenten

Verzending en opslag

Alle componenten worden verzonden met droogijs en kunnen een jaar lang bij -20°C worden bewaard.

Figuur

Een totaal van 500ng en 100ng menselijk bloed totaal RNA onderging respectievelijk rRNA verwijdering en gecombineerde rRNA & Globin verwijdering. Na bibliotheekconstructie en sequentiebepaling werd de inhoud van Globin mRNA vergeleken.

Voorzorgsmaatregelen

1. Gebruik verbruiksartikelen die vrij zijn van RNase-verontreiniging en reinig het experimentele gebied regelmatig. Het wordt aanbevolen om ThermoFisher's RNAZap te gebruiken^TM Spray voor het verwijderen van nucleïnezuur met een hoge efficiëntie om RNase-verontreiniging te verwijderen.

2. Het RNA-monster moet vrij zijn van genomische DNA-verontreiniging. Als gDNA in het monster achterblijft, moet het worden verteerd door DNase I en gezuiverd voor gebruik.

3. Het maximale invoervolume van het RNA-monster is 10 μL. Als het monstervolume groot is, kan het eerst worden geconcentreerd.

4. Voor uw veiligheid en gezondheid verzoeken wij u om tijdens de operatie een labjas en wegwerphandschoenen te dragen.

5. Alleen voor onderzoeksdoeleinden!

Instructies

1. Probe-hybridisatie naar RNA

1.1 Verdun 10 ng–1 μg totaal RNA met Nuclease-vrij Water tot een eindvolume van 10 μL in een PCR-buis. Houd het RNA op ijs.

1.2 Monteren de volgende RNA/Probe hybridisatiereactie op ijs volgens Tabel 1.

Tabel 1 RNA/Probe hybridisatiereactie

1.3 Meng grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren, ten minste 10 keer. Draai de buis kort in een microcentrifuge om de vloeistof van de zijkant van de buis te verzamelen.

1.4 Plaats de buis in een thermocycler en voer het volgende programma uit in Tabel 2, waarbij het verwarmde deksel is ingesteld op 105 °C.

Tabel 2 Reactieprogramma van RNA/Probe-hybridisatie

2. RNase H-vertering

2.1 Stel de volgende RNase H-digestiereactie samen op ijs volgens Tabel 3.

Tabel 3 RNase H-digestiereactie

2.2 Meng grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren, ten minste 10 keer. Draai de buis kort in een microcentrifuge om de vloeistof van de zijkant van de buis te verzamelen.

2.3 Plaats de buis in een thermocycler en voer het volgende programma uit: deksel 50°C; 37°C, 30 minuten; 4°C, vasthouden.

3.DNase I Spijsvertering

3.1 Stel de volgende DNase I-digestiereactie op ijs samen volgens Tabel 4.

Tabel 4 DNase Ⅰ verteringsreactie

3.2 Meng grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren, ten minste 10 keer. Draai de buis kort in een microcentrifuge om de vloeistof van de zijkant van de buis te verzamelen.

3.3 Plaats de buis in een thermocycler en voer het volgende programma uit: deksel eraf; 37°C, 30 minuten; 4°C, vasthouden.

4. RNA-zuivering

4.1 Breng de Hieff NGS in evenwicht^TMVerwarm RNA Cleaner (Cat.nr. 12602) op kamertemperatuur en roer de kralen grondig door ze te vortexen voordat u ze gebruikt.

4.2 Toevoegen 110 µL (2,2×) Voeg de RNA-korrels toe aan de RNA-oplossing uit stap 3.3 en meng grondig door minstens 10 keer op en neer te pipetteren.

4.3 Laat het 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen om RNA aan de kralen te binden.

4.4 Plaats het buisje op een magnetische standaard om de kralen van de supernatant te scheiden. Wanneer de oplossing helder is (ongeveer 3 minuten), gooi de supernatant weg. Wees voorzichtig dat u de kralen niet aanraakt met de pipetpunten.

4.5 Houd de buis op de magnetische standaard. Voeg 200 µL vers bereide 80% ethanol toe aan de buis. Incubeer 30 seconden bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Wees voorzichtig dat u de kralen niet aanraakt met de pipetpunten.

4.6 Herhaal stap 4.5 eenmaal voor in totaal twee wasbeurten.

4.7 Verwijder de resterende ethanol met 10 µL - pipetpunten. Laat de buis op de magnetische standaard staan ​​en laat de kralen aan de lucht drogen. Doe dit maximaal 5 minuten met het deksel open.

4.8 Haal de buis uit de magnetische standaard. Elueer het RNA van de kralen door 11 μL Nuclease-vrij water toe te voegen. Meng grondig door ten minste 10 keer op en neer te pipetteren en draai de buis kort rond.

4.9 Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op de magnetische standaard totdat de oplossing helder is (~ 3 minuten).

4.10 Breng 10 µL van de supernatant over in een nucleasevrije buis.

Let op: Als u op dit punt moet stoppen, kunnen de monsters bij -80°C worden bewaard.