Hoog NGS^TM DNA Library Prep Kit is een nieuwe generatie bibliotheekbouwpakket dat speciaal is ontwikkeld en ontworpen voor Illumina® &MGI® sequentieplatform. Op basis van de vorige generatie bibliotheekconstructiekits vertoont dit product een hogere efficiëntie in eindreparatie, dA-tailing en adapterligatie dan de vorige versies. Het high-fidelity-enzym verbetert de uniformiteit en betrouwbaarheid van amplificatie aanzienlijk. De kit is compatibel met de meeste DNA-monstertypen, waaronder standaard genomisch DNA van dieren/planten/micro-organismen, FFPE-monsters, cfDNA en ChIP-DNA.

Specificaties

Componenten

Opslag

Dit product moet worden bewaard bij -25~-15℃ gedurende 1 jaar.

Notities

1. Over de werking

1. Werk met labjassen en wegwerphandschoenen，voor uw veiligheid.

2. Laat de componenten ontdooien op kamertemperatuur. Na ontdooien, meng grondig door te vortexen, draai de buis kort rond en zet ze op ijs voor later gebruik.

3. Bij het voorbereiden van de reactieoplossing van elke stap, wordt aanbevolen om een ​​pipet te gebruiken om goed te mengen of voorzichtig te schudden. Krachtig schudden kan leiden tot een afname van de bibliotheekoutput.

4. Het wordt sterk aanbevolen om gefilterde pipetpunten te gebruiken om kruisbesmetting te voorkomen. Zorg ervoor dat u pipetpunten vervangt bij het verwerken van verschillende monsters.

5. Onjuiste handelingen kunnen zeer waarschijnlijk aerosolverontreinigingen veroorzaken, wat de nauwkeurigheid van het resultaat beïnvloedt. Verplichte fysieke isolatie van PCR-reactiemenggebieden en PCR-productzuiveringsassaygebieden wordt aanbevolen. Uitgerust met apparatuur zoals gespecialiseerde pipetten voor bibliotheekconstructie.Voer routinematig schoonmaken uit voor elk gebied door de oppervlakken af ​​te vegen met 0,5% natriumhypochloriet of 10% bleekmiddel

6. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.

2. DNA-fragmentatie

1. Deze kit is compatibel met zowel mechanisch gefragmenteerd als enzymatisch gefragmenteerd DNA.

2. De kit is compatibel met 100 pg - 1000 ng input DNA. Het wordt sterk aanbevolen om input DNA van hoge kwaliteit te gebruiken met A260/A280 = 1.8-2.0. Tabel 1 geeft de aanbevolen hoeveelheid Input DNA weer.

Tabel 1 De aanbevolen hoeveelheid Input DNA

Opmerking: Wanneer de invoer-DNA van slechte kwaliteit is of wanneer er een selectie van de DNA-grootte vereist is, moet de invoer-DNA-hoeveelheid dienovereenkomstig worden verhoogd.

3. Met “input DNA” worden specifiek de DNA-monsters bedoeld die klaar zijn voor eindreparatie/dA-tailing.

4. Een kralenzuiverings-/grootteselectiestap wordt aanbevolen na fragmentatie als het invoer-DNA-monster hoge concentraties zouten bevat, zoals het metaalchelerende middel. De zouten kunnen de efficiëntie van de volgende reacties beïnvloeden, waaronder eindreparatie en dA-tailing.Elueer de DNA-monsters in TE-buffer in plaats van gesteriliseerd ultrazuiver water voor fragmentatie als u de mechanische fragmentatiemethode gebruikt. Als u de enzymatische fragmentatiemethode gebruikt zonder kralenopruiming of grootteselectie uit te voeren voordat u doorgaat met de voorbereiding van de bibliotheek, zorg er dan voor dat de gebruikte stopbuffer geen overmatige hoeveelheid metaalchelerend middel bevat. Anders moet u de gefragmenteerde monsters opschonen of op grootte selecteren en ze elueren in TE-buffer of gesteriliseerd ultrazuiver water (≤50 μL) voordat u doorgaat met de voorbereiding van de bibliotheek.

3. Adapterligatie

1. Klanten kunnen kiezen uit Illumina of MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kits en korte adapter kits, afhankelijk van hun experimentele vereisten.

2. Het werd aanbevolen om hoogwaardige, commerciële adapters te selecteren. Als u zelfgemaakte adapters selecteert, vertrouw dan een bedrijf toe met ervaring in NGS-primersynthese en merk op dat er strikte contaminatiecontrole nodig is. Daarnaast wordt aanbevolen om DNA-annealingoplossing te bereiden in een schone werkbank en slechts één type adapter per keer te gebruiken om kruisbesmetting te voorkomen.

3. Laat de adapters ontdooien op ijs of bij 4°C. Bij gebruik op kamertemperatuur mag de laboratoriumtemperatuur niet hoger zijn dan 25°C om te voorkomen dat de adapters denatureren.

4. De kwaliteit en concentratie van de adapters hebben direct invloed op de ligatie-efficiëntie en de opbrengst van de bibliotheek. Een te hoge concentratie adapters bevordert de vorming van adapterdimeren, terwijl een te lage adapter de ligatiesnelheid en de opbrengst van de bibliotheek vermindert. Corresponderende verdunningen met TE-buffer volgens de hoeveelheid invoer-DNA bij gebruik van adapter. Tabel 2 -5 geeft de aanbevolen adapterverdunningsmethoden weer voor verschillende hoeveelheden invoer-DNA met behulp van deze kit.

Tabel 2 De aanbevolen Illumina™ adapterbedrag voor verschillende invoer-DNA

Tabel 3 De aanbevolen MGI™ adapterbedrag voor verschillende invoer-DNA

Tabel 4 De aanbevolen Illumina™ Hoeveelheid UMI-adapter voor verschillende invoer-DNA

Tabel 5 De aanbevolen MGI™ Hoeveelheid UMI-adapter voor verschillende invoer-DNA

4. Op kralen gebaseerde DNA-opruiming en grootteselectie

1. De selectie van de DNA-grootte kan worden uitgevoerd vóór eindreparatie/dA-tailing, na adapterligatie of na amplificatie.

2. Het wordt aanbevolen om de grootteselectie direct na de adapterligatie uit te voeren als de hoeveelheid DNA-invoer meer dan 50 ng bedraagt; Anders dient u de grootteselectie pas na de versterking uit te voeren.

3. De Ligation Enhancer bevat een hoge concentratie PEG, wat een significante impact kan hebben op de nauwkeurige maatselectie. Als maatselectie dus direct na adapterligatie moet worden uitgevoerd, wordt het sterk aanbevolen om een ​​stap voor het opruimen van kralen toe te voegen vóór de maatselectie. De stap voor maatselectie kan direct worden uitgevoerd als deze wordt uitgevoerd vóór de eindreparatie/dA-tailing of na de bibliotheekversterking.

4. De magnetische kralen moeten voor gebruik op kamertemperatuur worden gebracht, anders neemt de opbrengst af en wordt het effect van de grootteselectie beïnvloed.

5. De magnetische kralen moeten vóór gebruik goed worden gemengd door middel van vortexen of pipetteren.

6. Zuig de kralen niet op bij het overbrengen van de supernatant, zelfs sporen van de kralen kunnen de volgende reacties beïnvloeden.

7. De 80% ethanol moet vers worden bereid, anders heeft dit invloed op de winningsefficiëntie.

8. Voor een nauwkeurige grootteselectie wordt aanbevolen om te beginnen met een volume van meer dan 100 μL. Indien minder, wordt aanbevolen om het volume op te voeren tot 100 μL met ultrazuiver water.

9. De magnetische kralen moeten bij kamertemperatuur worden gedroogd voordat het product wordt geëlueerd. Onvoldoende droogte zal er gemakkelijk voor zorgen dat ethanolresten de daaropvolgende reacties beïnvloeden; overmatige droogte zal ervoor zorgen dat de magnetische kralen barsten en de zuiveringsopbrengst verminderen. Normaal gesproken is drogen bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten voldoende om de kralen volledig te laten drogen.

10. Indien nodig worden de gezuiverde of op grootte geselecteerde DNA-monsters geëlueerd in 0,1× TE-buffer kan 1-2 weken bewaard worden bij 4°C of een maand bij -20°C.

5. Bibliotheekversterking

1. Of er wel of geen bibliotheekamplificatie moet worden uitgevoerd, hangt af van de hoeveelheid DNA-invoer, typen adapters, de sequentiedatatoepassingen, enz. De amplificatiestap is vereist als er gedeeltelijke adapters worden gebruikt. Bij gebruik van adapters van volledige lengte wordt aanbevolen om amplificatie uit te voeren als het invoer-DNA < 200 ng is; anders is amplificatie niet nodig.

2. Amplificatiecyclusnummers moeten strikt worden gecontroleerd. Onvoldoende amplificatie kan leiden tot een lage bibliotheekopbrengst; Overamplificatie kan leiden tot verhoogde bias, fouten, gedupliceerde read en chimere producten. Tabel 6 geeft aanbevolen cyclusnummers weer die gericht zijn op een bibliotheekopbrengst van 1 μg.

Tabel 6 Het aanbevolen aantal cycli om te genereren 1.000 ng bibliotheekopbrengst

Opmerking：

1. Tabel 6 toont het aantal lusparameters met behulp van hoogwaardige invoer-DNA-testen van ongeveer 200 bp. De FFPE-DNA-kwaliteit varieert sterk en wanneer de DNA-kwaliteit slecht is of de bibliotheeklengte groot is, moet het aantal cycli dienovereenkomstig worden verhoogd om voldoende bibliotheken te verkrijgen.

2.IAls de grootte moet worden geselecteerd tijdens het bibliotheekopbouwproces, wordt een hoger cyclusnummer voor bibliotheekversterking aanbevolen. Anders wordt een lager cyclusnummer aanbevolen.

3.IIndien onvolledige adapters worden gebruikt, dienen er minimaal 2 cycli te worden versterkt om een ​​complete adapter te vormen.

6. Analyse van de bibliotheekkwaliteit

1. De kwaliteit van de geconstrueerde bibliotheken wordt over het algemeen geanalyseerd door de concentraties en grootteverdelingen te meten.

2. De concentraties in bibliotheken kunnen worden gemeten met behulp van op fluorescentie gebaseerde methoden zoals Qubit en PicoGreen of qPCR.

3. Het wordt NIET aanbevolen om op absorptie gebaseerde kwantificeringsmethoden zoals NanoDrop te gebruiken.

4. Het wordt aanbevolen om de qPCR-methode te gebruiken voor bibliotheekkwantificering: fluorescentiegebaseerde methoden zoals Qubit en PicoGreen kunnen de incomplete dsDNA-structuren (inserts zonder adapter of met slechts één van de uiteinden geligeerd met adapter) niet onderscheiden van de complete bibliotheken. De qPCR-methode zal alleen de complete bibliotheken met beide uiteinden geligeerd met adapters (de sequentiële bibliotheken) amplificeren en meten, waardoor een nauwkeurigere meting voor het laden wordt geboden.

5.De grootteverdeling van bibliotheken kan worden geanalyseerd met Agilent Bioanalyzer of andere apparaten die gebaseerd zijn op de principes van capillaire elektroforese of microfluïdica.

7. Andere materialen

1. DNA-zuiveringsmagnetische kralen: Hieff NGS^TM DNA-selectiekralen (Yeasen Cat#12601) of AMPure^® XP Beads (A63880) of andere gelijkwaardige producten.

2. Adapters: Complete adapter voor Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dubbele CDI-primers: Yeasen Kat#12412~Kat#12413; 384 Unieke Dual Index (UDI) Primers: Yeasen Kat #12312~Kat#12315; UMI UDI-adapters: Yeasen Kat#13370~Kat#13371; Complete adapter voor MGI: Yeasen Cat#13360-13362. DNA-primermix：Kat#12190 of Kat#12191.

3. Kwaliteitsanalyse van de bibliotheek: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip of andere gelijkwaardige producten; kwantitatieve reagentia voor de bibliotheek.

4. Overige materialen: absolute ethanol, steriel ultrapuur water, pipetpunten met lage retentie, PCR-buis, magnetische standaards, thermocycler, enz.

Instructies

Stap 1. Einde reparatie/dA-Taling

1. Dooi de reagentia genoemd in Tabel 7 . Keer de glazen om zodat de reagentia goed gemengd worden en zet ze op ijs voor later gebruik.

2. Stel de reagentia samen volgens tabel 7 op ijs.

Tafel 7 Einde reparatie/ dA-tailing reactiesysteem

3. Meng voorzichtig door te pipetteren of te schudden. Centrifugeer kort om de oplossing eruit te halen.

4. Plaats de buis in een thermocycler en stel het programma in volgens tabel 8.

Tabel 8 Einde reparatie/dA-tailing reactieprogramma

Stap 2. Adapter Ligatie

1. Verdun de adapter tot de juiste concentratie volgens Tabel 2-5.

2. Dooi de reagentia genoemd in Tabel 9 . Keer de glazen om zodat de reagentia goed gemengd worden en zet ze op ijs voor later gebruik.

3. Stel de reagentia samen volgens tabel 9 op ijs.

Tabel 9 Adapter Ligatie reactiesysteem

Opmerking: *De Ligation Enhancer is viskeus. Meng grondig door omkeren of vertexen en kort centrifugeren voor gebruik.

**De oorspronkelijke concentratie van de Illumina^TM adapter van YEASE is 15 μM. Verdun de adapter volgens de invoerhoeveelheid En Maak het volume van de adapter vast op 5 μL.

**De oorspronkelijke concentratie van de MGI^TM adapter van YEASE is 10 μM. Verdun de adapter overeenkomstig de invoerhoeveelheid En Maak het volume van de adapter vast op 5 μL.

4. Meng het geheel grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren en draai het mengsel kort rond om alle vloeistof van de zijkanten van de buis te verzamelen.

5. Broed het monster uit in een voorverwarmde thermocycler zoals weergegeven in Tabel 10 en voer de adapterverbindingsreactie uit.

Tabel 10 Adapter Ligatie reactieprogramma

Stap 3. Opruimen of maatselectie na adapterligatie

Deze stap is bedoeld om het product in stap 2 te zuiveren of op grootte te selecteren met magnetische kralen. De zuivering kan residu-adapters, adapterdimeren of andere onbruikbare producten verwijderen.

SchoonN van Adapter-geligeerd DNA

1. Voorbereiding: neem de Hieff NGS^TM DNA Selection Beads uit de koelkast halen en minstens 30 minuten op kamertemperatuur laten equilibreren. 80% ethanol vers bereiden.

2. Meng de kralen goed door ze om te draaien of te vertexen.

3. Voeg 88 toe μL Hoog NGS^TM Voeg DNA-selectieparels (0,8×, kralen : DNA = 0,8:1) toe aan de buis met het adapter-geligeerde product, schud en meng goed en laat 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

4. Centrifugeer kort om de oplossing naar beneden te krijgen en plaats de centrifugebuis op het magnetische rek. Nadat de magnetische kralen volledig zijn geadsorbeerd (ongeveer 5 min), verwijder voorzichtig de vloeistof.

5. Houd de buis op de magnetische standaard, Voeg direct 200 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buis. Incubeer 30 seconden bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de vloeistof.

6. Herhalen stap 5 opnieuw.

7. Laat het buisje op de magnetische standaard staan, open de dop en droog de kralen tot ze net gebarsten zijn (niet langer dan 5 minuten).

8. Haal de buis van de magnetische standaard voor elutie en het DNA elueren

1). Als het product niet op maat hoeft te worden geselecteerd, voeg dan 21 μL ddH toe₂O direct. Meng grondig door 10 keer te vortexen of op en neer te pipetteren. Incubeer 5 min. bij kamertemperatuur. Draai de buis kort en plaats deze op een magnetische standaard. Wanneer de oplossing helder is (ongeveer 5 min.), breng dan voorzichtig 20 μL supernatant over naar een nieuwe PCR-buis zonder de magnetische kralen aan te raken.

2). Als het product een bepaalde grootte moet krijgen, voeg dan 102 μL ddH toe₂O direct. Meng grondig door 10 keer te vortexen of op en neer te pipetteren. Incubeer 5 min. bij kamertemperatuur. Draai de buis kort en plaats deze op een magnetische standaard. Wanneer de oplossing helder is (ongeveer 5 min.), breng dan voorzichtig 100 μL supernatant over naar een nieuwe PCR-buis zonder de magnetische kralen aan te raken.

Opmerking: Als het gezuiverde product bewaard moet worden, kan het worden geëlueerd met TE-buffer.

Grootteselectie van adapter-geligeerd DNA

1. Voorbereiding: neem de Hieff NGS^TM DNA Selection Beads uit de koelkast halen en minstens 30 minuten op kamertemperatuur laten equilibreren. 80% ethanol vers bereiden.

2. Meng de kralen goed door ze om te draaien of te vertexen.

3. Voeg op basis van de beoogde groottes de eerste ronde kralen toe aan de gezuiverde DNA-sjablonen van 100 μL volgens tabel 11Meng grondig door 10 keer te vortexen of te pipetteren.

Tafel 11 Aanbevolen kralen:DNA-verhoudingen voor kralen-gebaseerde maatselectie

Opmerking: "×" in de tabel geeft het volume van het DNA-monster aan. Als de insertlengte van de bibliotheek bijvoorbeeld 250 bp is en het DNA-monstervolume 100 μL is, is het volume van de magnetische kralen die in de eerste sorteerronde worden gebruikt 0,7 × 100 μL = 70 μL; het volume van de magnetische kralen die in de tweede sorteerronde worden gebruikt, is 0,20 × 100 μL = 20 μL. Het aanbevolen kralenvolume in de tabel is voor het adapter-geligeerde DNA. Als de grootteselectieprocedure vóór de ligatie wordt uitgevoerd, raadpleeg dan de fabricageprotocollen van Hieff NGS^TM DNA-selectiekralen (Cat#12601).

4. Laat 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

5. Draai de buis kort en plaats deze op een magnetische standaard. Wanneer de oplossing helder is (ongeveer 5 min), breng de supernatant over naar een nieuwe PCR-buis.

6. Voeg de tweede ronde selectiekralen toe aan het monster uit stap 5 volgens tabel 11Meng grondig door minimaal 10 keer te vortexen of op en neer te pipetteren.

7. Laat 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

8. Centrifugeer kort om de oplossing naar beneden te krijgen en plaats de centrifugebuis op het magnetische rek. Nadat de magnetische kralen volledig zijn geadsorbeerd (ongeveer 5 min), verwijder voorzichtig de vloeistof.

9. Houd de buis op de magnetische standaard, Voeg direct 200 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buis. Incubeer 30 seconden bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de vloeistof.

10. Herhalen stap 9 opnieuw.

11. Laat het buisje op de magnetische standaard staan, open de dop en droog de kralen tot ze net gebarsten zijn (niet langer dan 5 minuten).

12. Haal de buis van de magnetische standaard voor elutie en voeg direct 21 μL ddH toe₂O. Meng grondig door te vortexen of op en neer te pipetteren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. (Let op: indien het gezuiverde product bewaard moet worden, elueer dan in TE-buffer.) Draai de buis kort naar beneden en plaats deze op een magnetische standaard totdat de vloeistof helder wordt (ongeveer 5 minuten). Breng voorzichtig 20 μL supernatant over naar een nieuwe PCR-buis zonder de kralen aan te raken.

Stap 4 Bibliotheekversterking

Met deze stap kunnen de gezuiverde of op grootte geselecteerde producten worden verrijkt door PCR-amplificatie.

1. Ontdooi de reagentia uit tabel 12, keer ze om, meng ze grondig en zet ze op ijs voor later gebruik.

2. Zet de volgende reactie in een gesteriliseerde PCR-buis.

Tabel 12 adapter-geligeerde DNA PCR-reactie systeem

[Opmerking]: * als de complete adapter is gebruikt, Hoog NGS^TM Primer-mix (Yeasen Cat#12190 of Cat#12191) in behoefte; Als er een onvolledige adapter wordt gebruikt (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Kat#12315, Cat#13370~Cat#13371), raadpleeg de instructies in de kit en gebruik de Index Primer die in de kit is meegeleverd voor amplificatie.

3. Meng voorzichtig door te pipetteren of te schudden en centrifugeer kort om de oplossing eruit te halen.

4. Plaats de buis in een thermocycler en stel het programma in volgens tabel 13 om de versterking te starten.

Tabel 13 PCR-amplificatiereactieprogramma

Stap 5 Opruimen na amplificatie/grootteselectie

De schone omhoog stappen verwijzen naar stap 3. Hoog NGS^TM DNA Selection Beads (0,9×, Beads:DNA=0,9:1) worden gebruikt om het PCR-product te zuiveren. Als u een maatselectie nodig hebt, raadpleeg dan stap 3.

Stap 6 Kwaliteitscontrole van de definitieve bibliotheken

De kwaliteit van de geconstrueerde bibliotheek wordt over het algemeen geëvalueerd door de concentratie en grootteverdeling te meten. Voor details, zie Noot 6.