Hifair™ V Multiplex One Step RT-qPCR-sondekit (UDG Plus) is een multiplex kwantitatieve PCR-kit op basis van RNA als template. Tijdens het experiment werden reverse transcriptie en kwantitatieve PCR in dezelfde buis uitgevoerd, wat de experimentele operatie vereenvoudigde en het risico op contaminatie verminderde.

In deze kit werd de eerste streng cDNA efficiënt gesynthetiseerd door hittebestendige Hifair^TM V Reverse Transcriptase en kwantitatief versterkt door UNICON^TM HotStart Taq DNA Polymerase. De kit bevat voornamelijk geoptimaliseerde MP-buffer, enzymenmix, etc. De bufferoplossing bevat al Mg²⁺ en dNTP. Bovendien worden de factoren toegevoegd die effectief de niet-specifieke PCR-amplificatie kunnen remmen en de amplificatie-efficiëntie van meerdere qPCR-reacties kunnen verbeteren, wat de amplificatie-efficiëntie kan garanderen en tot meerdere amplificatiereacties kan uitvoeren. Het dUTP/UDG-systeem werd toegevoegd om het risico op aerosolverontreiniging effectief te voorkomen.

Functies

Hoge gevoeligheid：Het zorgvuldig geoptimaliseerde buffersysteem verbetert de detectiegevoeligheid van sjablonen met een lage concentratie tot 250 kopieën/ml；

Uitstekende stabiliteit: het product heeft 18 maanden lang realtime stabiliteitstests doorstaan.

dUP/UDG anti-vervuilingssysteem：Het dUTP/UDG-antivervuilingssysteem wordt geïntroduceerd om de aerosolvervuiling van producten efficiënt af te breken, vals-positieve resultaten te verminderen en authentieke resultaten te garanderen；

Ondersteuning voor snel programma: compatibel met snel programma, 40 minuten kan resultaten opleveren;

Componenten

Opmerking: 1) 2×Hifair^TM V MP-buffer is de afkorting van Hifair^TM V Multiplex Eén Stap RT-qPCR Probe Buffer, waaronder dNTP's, dUTP, Mg2+, stabilisatoren, versterkers en meer.

2) Hifair^TM V-enzymmix bevat voornamelijk hittebestendig Hifair^TM V-reverse transcriptase, UNICONTM HotStart Taq DNA-polymeren en UDGas.

Opslag

THij product zou moeten zijn opgeslagen bij -25°C~-15°C voor 18 maanden.

Instructies

Reactie samenstelling

Opmerking：Zorg ervoor dat u het mengsel goed mengt voor gebruik. Voorkom dat er te veel luchtbellen ontstaan ​​door hevige trillingen.

a) Inleiding/Doorvragen concentratie: Inleiding mix inclusief multiplex primer, Afhankelijk van de situatie kan de optimale primerconcentratie tussen 0,1 en 1,0 μM liggen.Sondemix met multiplex-sonde-etikettering en verschil in fluorescerende groep. Afhankelijk van de situatie kan de optimale sondeconcentratie tussen 0,05 en 0 liggen.5 μM.

c) Templateverdunning: qPCR is zeer gevoelig en het wordt aanbevolen om de template te verdunnen. De controle-Ct-waarde is geschikt tussen 20 en 35.

D) Systeemvoorbereiding: ontkop met filterelement. Vermijd kruisbesmetting en aerosolbesmetting.

Geoptimaliseerd fietsprotocol

Opmerking：een) Romgekeerde transcriptie: De temperatuur kan 42 selecteren°C of 50°C gedurende 10-15 minuten.

b) Amplificatiereactie: De temperatuur wordt aangepast op basis van de Tm-waarde van de ontworpen primers.

C) Fluorescentie signaal acquisitie: Stel de experimentele procedure in volgens de vereisten in de handleiding van het instrument.

3. Sollicitatie apparatuur

Uitrusting met Rox：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Snel, StepOne™, StepOne Plus™

Uitrusting met Low Rox：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 en 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Uitrusting zonder Rox：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Toegepaste Wetenschap LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Thermisch Wetenschappelijke PikoReal Cycler; Cepheïden SmartCycler®; Verlicht Eco-qPCR

Notities

Draag de nodige PBM, zoals een labjas en handschoenen, om uw gezondheid en veiligheid te waarborgen.!

Gebruik alstublieft RNasefree verbruiksartikelen voor het experiment.

Gevoeligheidstest

De 13650 die 18 maanden bij -20°C werden bewaard (experimentele groep) en die binnen de houdbaarheidstermijn (controlegroep) werden gelijktijdig getest op de gradiëntverdunning (500 kopieën/ml, 250 kopieën/ml) van het pseudovirus SARS-CoV-2, gericht op het ORF-gen en het N-gen. Acht replicaatputten werden getest voor elke concentratie, met een detectiepercentage van 100%. Bovendien waren er geen significante verschillen in de piekvormen van de amplificatiecurve en Ct-waarden.

Realtime stabiliteitstest

De 13650 werd 18 maanden bewaard bij -20°C en die binnen hun houdbaarheidstermijn. Beide groepen werden gelijktijdig getest op het SARS-CoV-2 pseudovirus ORF-gen en N-gen in een concentratie van 1000 kopieën/ml met 20 replicatenputjes. De detectiegraad voor beide was 100% en er waren geen significante verschillen in de vorm van de amplificatiecurven of de Ct-waarden.

Figuur 1. Rred: 13650 binnen hun houdbaarheidstermijn；blauw：13650 18 maanden bewaard bij -20°C。

Stabiele prestaties na herhaalde vries-dooicycli

Door het 13650-reagens te onderwerpen aan 30 en 50 vries-dooicycli met droogijs, naast reagentia die normaal gesproken bij -20°C worden bewaard, en door gelijktijdig te testen op het SARS-CoV-2 pseudovirus ORF-gen, gaven de resultaten aan dat de prestaties van het 13650-reagens niet werden beïnvloed na 50 vries-dooicycli.

Figuur 2. Rood: 13650 normaal opgeslagen bij -20°C; Paars：13650 tot 30 vries-dooicycli；Groente：13650 tot 50 vries-dooicycli.

Compatibel met standaard- en snelle protocollen

Met behulp van 13650ES werden het ORF-gen en het N-gen van het SARS-CoV-2-pseudovirus gedetecteerd onder hetzelfde reactiesysteem met zowel standaard- als snelle protocollen. De resultaten toonden aan dat er onder een 4-plex-systeem geen verschil was in de piekvormen van de amplificatiecurve en Ct-waarden tussen de twee protocollen.

Documenten:

Handleidingen