Niet-specifieke amplificatie van Taq DNA-polymerase is een veelvoorkomend probleem bij PCR-experimenten, wat direct van invloed is op de interpretatie van detectieresultaten en kan leiden tot een afname van de amplificatiegevoeligheid en zelfs een vermindering van de opbrengst van het doelfragment. Het gebruik van enzymmodificatoren om het actieve centrum van Taq DNA-polymerase bij kamertemperatuur af te sluiten, waardoor de DNA-polymerase-activiteit van Taq-enzym bij kamertemperatuur wordt geremd, is momenteel de meest effectieve methode om niet-specifieke amplificatie te onderdrukken. De door Yisheng ontwikkelde dual-sealing-antilichamen sluiten niet alleen de polymerase-activiteit van Taq DNA-polymerase af, maar sluiten tegelijkertijd ook de exonuclease-activiteit van Taq DNA-polymerase af. Deze duale aanpak voorkomt effectief niet-specifieke amplificatie veroorzaakt door verkeerde paring of primerdimeren en voorkomt ook de generatie van niet-specifieke signalen als gevolg van materiaaldegradatie, waardoor de specificiteit van het reagens dubbel wordt verbeterd. Dit stelt detectiereagentia in staat om gemakkelijk om te gaan met transport of gebruik bij kamertemperatuur.

1.Ultrahoge amplificatiespecificiteit: het dubbel afgedichte antilichaam kan tegelijkertijd zowel polymerase- als exonucleaseactiviteiten afsluiten, waardoor niet-specifieke amplificatie effectief wordt vermeden en de specificiteit wordt verbeterd.

2.Uitzonderlijke detectiegevoeligheid: de hot-startformulering zorgt voor effectieve detectie van genen met een lage prevalentie en biedt een hogere gevoeligheid.

3.Uitstekende productstabiliteit: stabiele prestaties bij plaatsing op 37°C gedurende 5 dagen of op 4°C gedurende 10 dagen.

4.Basislijnstabiliteit en goede lineariteit: het probleem van basislijndrift wordt aangepakt, wat resulteert in uitstekende lineariteit.

5.Snelle afgifte van enzymactiviteit: meer dan 95% van de enzymactiviteit kan worden afgegeven door verhitting op 95°C gedurende 20 seconden.

6.Brede toepasbaarheid van enzymen: geschikt voor zowel wilde-type als gemuteerde Taq-enzymen, waarbij elke mg antilichaam 4-10 KU Taq-enzym kan afsluiten.

1 Blokkering van Taq DNA polymerase exonuclease activiteit

Synthetische primer probes werden respectievelijk opgenomen in de reactiemengsels van Taq DNA polymerase die ofwel niet-afgesloten waren ofwel afgedicht met dual-closure antilichamen, en de reacties werden uitgevoerd bij 40°C. De fluorescentiesignalen van beide werden gedetecteerd, en het werd gevonden dat de dual-closure antilichamen de exonuclease-activiteit van Taq DNA polymerase effectief kunnen afdichten.

Figuur 2. Detectie van de afdichtingsefficiëntie van dubbel-afgesloten antilichaam-endonuclease-activiteit.

02 Verificatie van detectiegevoeligheid

Respectievelijk met behulp van Yeasen's dubbel verzegelde antilichaam en het antilichaam van T Company om het Taq-enzym te verzegelen, gevolgd door detectie van positieve monsters door middel van ARMS-PCR-technologie, werd ontdekt dat het Taq-enzym verzegeld door YeasenHet dubbel verzegelde antilichaam was nauwkeurig bij ARMS-PCR-amplificatie met een hogere gevoeligheid.

Rood:Yeasen antilichaam+Taq; Blauw: leverancier A antilichaam + Taq.

Figuur 3. Amplificatiecurve van ARMS-PCR.

03 Stabiliteitscontrole (4°C gedurende 10 dagen, 37°C gedurende 5 dagen).

Met behulp van traditionele gesloten antilichamen en dubbelgesloten antilichamen om respectievelijk Taq DNA-polymerase te blokkeren, wordt de polymerase vervolgens geformuleerd tot een complete premixoplossing met primers en probes. Deze oplossing wordt 10 dagen bij 4°C of 1, 3 en 5 dagen bij 37°C gelaten en vervolgens gebruikt om 10.000 kopieën van het ASF-plasmide te amplificeren. Er werd waargenomen dat er geen significante veranderingen waren in de amplificatiecurven en Ct-waarden.

Figuur 4. Amplificatiecurven van 10.000 kopieën van ASF-plasmide nadat Taq-polymerase werd geblokkeerd met traditioneel blokkerend antilichaam (A) en dubbelgeblokkeerd antilichaam (B), versterkt door het systeem van qPCR.

04 Basislijndetectie

In bepaalde omstandigheden waarbij specifieke primers worden gebruikt in combinatie met bepaalde buffers en instrumenten, kan een fenomeen optreden dat bekend staat als baseline drift. Het gebruik van dubbelgesloten antilichamen kan echter effectief het probleem van baseline drift aanpakken, waardoor een stabielere baseline wordt gefaciliteerd.

Figuur 5. Amplificatiecurven van het SARS-CoV-2 N-gen (A) en het ACT-gen (B) in qPCR-analyse.

05 Lineariteitsverificatie

Het reactiemengsel, afgesloten met dubbelgesloten antilichamen, werd gebruikt om 100.000, 10.000, 1.000 en 100 kopieën van het ASFV/ACT-dubbelplasmide te amplificeren om een ​​standaardcurve te genereren. Zoals te zien is in Figuur 7, vertonen beide een goede lineariteit.

Figuur 6. Standaardcurvegrafieken voor het ASFV-gen en het ACT-gen gegenereerd met behulp van een dubbelblokreactiemengsel.

06 Enzymatische activiteitsvrijgavetest

Met behulp van de dubbelgesloten antilichamen (Cat#31303) van Yeasen om Taq-enzym te verzegelen en het gedurende 20 seconden aan een thermische schok bij 95°C te onderwerpen, werd de enzymatische activiteit gedetecteerd. Er kan worden waargenomen dat na een thermische schok van 20 seconden bij 95°C, 31303 meer dan 95% van de enzymatische activiteit kan vrijgeven, wat vergelijkbaar is met de antilichamen van Bedrijf T.

Tabel 1. Hitteschok bij 95°C gedurende 20 seconden van het enzym.

07 Multiplex Taq Polymerase Detectie

Yeasen's dubbelgesloten antilichamen (Cat#31303) werden gebruikt om drie typen Taq-polymerasen (wildtype + twee mutante typen) te verzegelen, met een verzegelingsverhouding van 1 μg tot 5U, en de fluorescentiewaarden en verzegelingsefficiëntie werden gemeten. Er werd vastgesteld dat voor verschillende typen Taq-polymerasen, YeasenDe dubbelgesloten antilichamen (Cat#31303) vertoonden een goed afsluitend effect.

Tabel 2. Geblokkeerde efficiëntie van verschillende typen Taq-polymerase.