Beschrijving
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) is een snelle en zeer gevoelige detectiekit op basis van het WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazolium mononatriumzout) reagens. WST-8 is een geüpgraded reagens van MTT en kan door dehydrogenases in de mitochondriën worden gereduceerd tot een zeer wateroplosbaar oranjegeel formazan. De hoeveelheid gegenereerd formazan is evenredig met het aantal levende cellen. De OD-waarde van formazan bij 450 nm gedetecteerd door een microplate reader kan indirect het aantal levensvatbare cellen aangeven. Deze kit wordt veel gebruikt voor medicijnscreening, celproliferatie- en cytotoxiciteitstests, tumorgeneesmiddelgevoeligheidstesten en activiteitsdetectie van biologische factoren.
Voordelen van de CCK-8-methode
1. Vergelijking van de CCK-8-methode met andere methoden voor het detecteren van celproliferatie/toxiciteit.
| Detectiemethode | MTT-methode | XTT-methode | WST - 1 methode | CCK 8-methode |
|---|---|---|---|---|
| Wateroplosbaarheid van het formazanproduct | Laag (er moet een organisch oplosmiddel worden toegevoegd om het op te lossen en vervolgens moet er een test worden uitgevoerd) | Hoog | Hoog | Hoog |
| Producteigenschappen | Poeder | 2 flessen oplossing | Oplossing | 1 fles oplossing |
| Gebruikswijze | Meng in oplossing en gebruik | De oplossing werd vlak voor gebruik bereid. | Uit de doos | Uit de doos |
| Detectiegevoeligheid | Hoog | Zeer hoog | Zeer hoog | Hoog |
| Detectie tijd | Lang | Kort | Kort | De kortste |
| Detectiegolflengte | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
| cytotoxiciteit | Hoge toxiciteit, volledige verdwijning van celmorfologie | Lage toxiciteit, celmorfologie onveranderd | Laag toxiciteit, celmorfologie onveranderd | Lage toxiciteit, celmorfologie onveranderd |
| Reagens stabiliteit | Algemeen | Laag | Algemeen | Hoog |
| Bulkmonster testen | Redelijk | Gepast | Gepast | Gepast |
2. Fenolrood en serum verstoren de detectie van CCK-8 niet.
3. Omdat de cytotoxiciteit van CCK-8-reagens zeer laag is, kan de optimale meettijd worden bepaald door herhaaldelijk met een microtiterplaatlezer te meten op verschillende tijdstippen na toevoeging van CCK-8-reagens.
Verzending en opslag
Het product kan twee jaar bewaard worden bij een temperatuur van -25~-15ºC op een droge en donkere plaats.
Voorzorgsmaatregelen
1. In het eerste experiment wordt aanbevolen om het optimale aantal geplateerde cellen en de optimale incubatietijd van het CCK-8-reagens te bepalen.
2. Gebruik indien mogelijk een multikanaalspipet om variaties tussen replicatenputjes te verminderen. Vermijd bellen in het experiment, omdat bellen de OD-meting verstoren. Bij het toevoegen van het CCK-8-reagens wordt aanbevolen om het dicht bij de wand van de kweekplaat toe te voegen in plaats van het in het kweekmedium te plaatsen.
3. Witte bloedcellen hebben mogelijk een langere incubatietijd nodig.
4. Bij gebruik van een standaard 96-wells plaat is het aantal geplateerde cellen ten minste 1.000 cellen/well (100 μL). De detectiegevoeligheid voor witte bloedcellen is relatief laag, dus het wordt aanbevolen om ten minste 2.500 cellen/well (100 μL) te platen. Bij gebruik van een 24-wells of 6-wells plaat, bereken het corresponderende aantal cellen voor elke well en voeg het juiste volume CCK-8-reagens toe (het volume van het toegevoegde CCK-8-reagens is 10% van het volume van het kweekmedium in elke well van de plaat).
5.Als het 450 nm-filter niet beschikbaar is, kan een filter met een absorptie tussen 430-490 nm worden gebruikt. Het 450 nm-filter kan echter de hoogste detectiegevoeligheid bereiken.
6. Fenolrood heeft geen invloed op de meting, omdat de absorptie van fenolrood in het medium kan worden geëlimineerd door de absorptie van de blanco groep af te trekken.
7. Draag voor uw eigen veiligheid en gezondheid een laboratoriumjas en wegwerphandschoenen wanneer u het experiment uitvoert.
Instructies
I. Maak een standaardcurve
1. Bereid de celsuspensie voor, bepaal de celdichtheid en plaat de cellen vervolgens uit.
2. Verdun de cellen sequentieel met het kweekmedium volgens een bepaalde verhouding (bijvoorbeeld een verhouding van 1:2) om een celconcentratiegradiënt te vormen, over het algemeen 3-5 celconcentratiegradiënten, 3-6 replicaatputjes voor elke concentratie.
3. Na het plateren, kweek de cellen gedurende 2-4 uur om ze te laten hechten. Voeg vervolgens het CCK-8-reagens toe, incubeer gedurende een bepaalde periode en meet de OD-waarde. Teken een standaardcurve met het celnummer als de X-as en de OD-waarde als de Y-as. Volgens deze standaardcurve kan het celnummer in een onbekend monster worden bepaald (de premisse van het gebruik van deze standaardcurve is dat de experimentele omstandigheden consistent moeten zijn).
II. Celviabiliteitstest
1. Plaats cellen (100 μL/well) in een 96-wells plaat. Plaats de plaat in een incubator (37°C, 5% CO2) gedurende een bepaalde tijd voor pre-incubatie.
2. Voeg 10 μL CCK-8-reagens toe aan elk putje (pas op dat er geen bellen in de putjes komen, omdat deze de OD-meting verstoren) en meng voorzichtig.
3. Plaats de plaat in de broedstoof en laat deze 1 tot 4 uur incuberen.
4. Meet de absorptie bij 450 nm met een microplate reader.
5. Als de OD-waarde niet onmiddellijk wordt gemeten, voeg dan 10 μL 0,1 M HCl-oplossing of 1% w/v SDS-oplossing toe aan elke well, bedek de plaat en bewaar deze beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. De absorptiewaarde verandert niet binnen 24 uur.
III. Celproliferatie- en cytotoxiciteitstest
1. Plaats cellen (100 μL/well) in een 96-wells plaat. Plaats de plaat in een incubator (37°C, 5% CO2) gedurende 24 uur voor pre-incubatie.
2. Voeg 10 μL van verschillende concentraties van de te testen stof toe aan de plaat.
3. Plaats de plaat in de broedstoof en laat deze gedurende een bepaalde tijd broeden (bijvoorbeeld 6, 12, 24 of 48 uur).
4. Voeg 10 μL CCK-8-reagens toe aan elke well (pas op dat er geen bellen in de wells ontstaan, omdat deze de OD-meting verstoren) en meng voorzichtig.
5. Plaats de plaat in de broedstoof en laat deze 1 tot 4 uur broeden.
6. Meet de absorptie bij 450 nm met een microplate reader.
7. Als de OD-waarde niet onmiddellijk wordt gemeten, voeg dan 10 μL 0,1 M HCl-oplossing of 1% w/v SDS-oplossing toe aan elke well, bedek de plaat en bewaar deze met bescherming tegen licht bij kamertemperatuur. De absorptiewaarde verandert niet binnen 24 uur.
Opmerking: Als de stof oxiderend of reducerend is, vervang dan het oude kweekmedium door vers medium (verwijder het oude medium, was de cellen twee keer met vers medium en voeg vervolgens vers medium toe) voordat u het CCK-8-reagens toevoegt om het effect van de stof te elimineren.Als de substantie zelf slechts A licht effect op de absorptiewaarde, is het niet nodig om het kweekmedium te vervangen en kan het effect van de stof worden geëlimineerd door de absorptiewaarde van een blanco groep met de stof af te trekken.
Berekeningsformule
Celoverlevingspercentage =[(AC) /(BC)] x100%
Remmingspercentage =[(BA) /(BC)] x100%
A: De absorptie van de experimentele groep (de absorptie van het kweekmedium met cellen, CCK-8-reagens en de te testen stof)
B: De absorptie van de controlegroep (de absorptie van het kweekmedium met cellen, CCK-8-reagens)
C: De absorptie van de blanco groep (de absorptie van het kweekmedium dat CCK-8-reagens bevat)
Citaten
[1] Zon L, Li P, Ju X, et al. In vivo structurele karakterisering van het SARS-CoV-2 RNA-genoom identificeert gastheerproteïnen die kwetsbaar zijn voor hergebruikte geneesmiddelen. Cell. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(IF:41.584)
[2] Wei S, Zhao Q, Zheng K, et al. GFAT1-gekoppelde TAB1-glutamylering ondersteunt p38 MAPK-activering en bevordert de overleving van longkankercellen onder glucoseverhongering. Cell Discov. 2022;8(1):77. Gepubliceerd op 9 aug. 2022. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(IF:38.079)
[3] Chen X, Zhang D, Su N, et al. Visualiseren van RNA-dynamiek in levende cellen met heldere en stabiele fluorescerende RNA's. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(IF:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. Ferroptosis heterogenity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy [online gepubliceerd vóór druk, 11 oktober 2022]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(IF:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX, et al. GM-CSF bemiddelt immuunontwijking via opregulatie van PD-L1-expressie bij extranodaal natural killer/T-cellymfoom. Mol Cancer. 2021;20(1):80. Gepubliceerd op 29 mei 2021. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(IF:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y, et al. SARS-CoV-2 envelop-eiwit veroorzaakt acute respiratory distress syndrome (ARDS)-achtige pathologische schade en vormt een antiviraal doelwit. Cell Res. 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(IF:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y, et al. FBXO34 bevordert latente HIV-1-activering door posttranscriptionele modulatie. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(IF:19.568)
[8] Zhou Z, Zhang X, Lei X, et al.Sensing van cytoplasmatisch chromatine door cGAS activeert aangeboren immuunrespons bij SARS-CoV-2-infectie. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):382. Gepubliceerd 2021 nov 3. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(IF:18.187)
[9] Li M, Hao B, Zhang M, et al. Melatonine verbetert radiofrequentie-geïnduceerde NK-antitumorimmuniteit, wat leidt tot herprogrammering van het kankermetabolisme en remming van de ontwikkeling van meerdere longtumoren. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):330. Gepubliceerd op 1 sep 2021. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(IF:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X, et al. WWC-eiwitten bemiddelen LATS1/2-activering door Hippo-kinasen en impliceren een tumorsuppressiestrategie. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(IF:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X, et al. Argininemonomethylering door PRMT7 controleert MAVS-gemedieerde antivirale aangeboren immuniteit. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(IF:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. Supramoleculaire fotodynamische middelen voor gelijktijdige oxidatie van NADH en generatie van superoxideradicaal. Nat Commun. 2022;13(1):6179. Gepubliceerd 2022 okt 19. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(IF:17.694)
[13] Zhong J, Guo Y, Lu S, et al. Rationeel ontwerp van een gevoeligheidsverbeterde tracer voor het ontdekken van efficiënte APC-Asef-remmers. Nat Commun. 2022;13(1):4961. Gepubliceerd op 24 aug. 2022. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(IF:17.694)
[14] Liu F, Wang X, Duan J, et al. Een tijdelijke PROTAC-cocktail-gemedieerde opeenvolgende afbraak van AURKA heft acute myeloïde leukemiestamcellen op. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(IF:16.806)
[15] Ji C, Qiu M, Ruan H, et al. Transcriptoomanalyse onthulde de symbiose-niche van 3D-steigers om de genezing van botdefecten te versnellen. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(IF:16.806)
[16] Feng L, Dou C, Xia Y, et al. Neutrofiel-achtige celmembraan-gecoate nanozymtherapie voor ischemische hersenschade en langdurig neurologisch functioneel herstel. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(IF:15.881)
[17] Wang Z, Gong X, Li J, et al. Zuurstofafgevende polyfluorocarbon nanovehicles verbeteren de zuurstofvoorziening van tumoren en versterken de fotodynamische antitumorimmuniteit. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(IF:15.881)
[18] Jiang Z, He L, Yu X, et al. Antiangiogenese gecombineerd met remming van het hypoxiepad vergemakkelijkt lage dosis, röntgenstraling-geïnduceerde fotodynamische therapie [online gepubliceerd vóór druk, 25 juni 2021]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(IF:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X, et al. Microvesikel-geïnspireerd zuurstofafleverend nanosysteem versterkt radiotherapie-gemedieerde modulatie van tumorstroma en antitumorimmuniteit. Biomaterials. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(IF:15.304)
[20] Deng J, Xu W, Lei S, et al. Geactiveerde Natural Killer Cells-afhankelijke dendritische cellen rekrutering en rijping door responsieve nanogels voor het richten op alvleesklierkankerimmunotherapie. Klein. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(IF:15.153)
Betaling en beveiliging
Uw betalingsinformatie wordt veilig verwerkt. We slaan geen creditcardgegevens op en hebben geen toegang tot uw creditcardinformatie.
Navraag
Misschien vind je het ook leuk
FAQ
Het product is alleen bedoeld voor onderzoeksdoeleinden en is niet bedoeld voor therapeutisch of diagnostisch gebruik bij mensen of dieren. Producten en inhoud worden beschermd door patenten, handelsmerken en auteursrechten die eigendom zijn van
Voor bepaalde toepassingen zijn mogelijk aanvullende intellectuele eigendomsrechten van derden vereist.