De Annexin V-EGFP/PI-cel-apoptosedetectiekit gebruikt EGFP-gelabelde Annexin V als probe om het optreden van vroege cel-apoptose te detecteren.
Het detectieprincipe is als volgt: in normale levende cellen bevindt fosfatidylserine (PS) zich aan de binnenkant van het celmembraan, maar in vroege apoptotische cellen flipt PS van de binnenkant van het celmembraan naar het oppervlak van het celmembraan en wordt blootgesteld aan de extracellulaire omgeving. Annexine-V is een Ca²⁺ -afhankelijk fosfolipide-bindend eiwit met een moleculair gewicht van 35 tot 36 kDa dat met hoge affiniteit aan PS bindt. De fosfatidylserine kan aan het membraan van vroege apoptotische cellen binden via de blootgestelde fosfatidylserine aan de buitenkant van de cel.
Bovendien wordt Propidium Iodide (PI) verstrekt om overlevende vroege cellen te onderscheiden van necrotische of laat-apoptotische cellen. PI is een nucleïnezuurkleurstof die niet door het intacte celmembraan van normale cellen of vroeg-apoptotische cellen kan passeren, maar wel door het celmembraan van laat-apoptotische en necrotische cellen en de kern rood kan maken. Dus toen Annexin V werd gecombineerd met PI, werd PI uitgesloten van levende cellen (Annexin V^-/PI^-) en vroege apoptotische cellen (Annexin V⁺/PI^-). De laat-apoptotische en necrotische cellen waren dubbelpositief voor zowel EGFP als PI (Annexin V⁺/PI⁺).
Deze kit is geschikt voor flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie.

Productcomponenten

Verzending en opslag

De onderdelen worden geleverd met een koelelement en kunnen worden bewaard bij -20°C. Bescherm ze tegen licht en vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien gedurende 1 jaar.
[Opmerkingen]: Als het binnen een korte periode herhaaldelijk gebruikt moet worden, kan het een half jaar lang bij 4 ℃ en beschermd tegen licht bewaard worden.

Voorzorgsmaatregelen

1) Omdat apoptose een snel proces is, wordt aanbevolen om monsters binnen 1 uur na kleuring te analyseren.
2) Voor aanhechtende cellen is vertering een cruciale stap. Gebruik geen EDTA in de verteringsoplossing, omdat EDTA de binding van Annexin V aan PS kan beïnvloeden.
3) Annexin V-FITC, maar niet Annexin V-EGFP, moet worden gebruikt om cellen te fixeren, zoals om apoptose en celcyclus tegelijkertijd te detecteren, omdat EGFP gedenatureerd zou worden en zijn vermogen om fluorescentie te exciteren zou verliezen tijdens fixatie. Cellen werden geïncubeerd met Annexin V-FITC vóór fixatie en ongebonden Annexin V-FITC werd weggespoeld met Binding Buffer.Omdat de verhoogde celpermeabiliteit tijdens de fixatie zorgt voor celresten die zich aan Annexine V kunnen binden en de resultaten kunnen verstoren.
4) Als het monster uit bloed komt, zorg er dan voor dat u bloedplaatjes uit het bloed verwijdert. Omdat bloedplaatjes PS bevatten, dat zich kan binden aan Annexin V, wat de resultaten kan verstoren. Bloedplaatjes kunnen worden weggespoeld door een buffermiddel met EDTA te gebruiken en te centrifugeren op 200 g.
5) Centrifugeer het reagens kort voordat u het deksel opent en giet de vloeistof via de binnenwand van het deksel naar de bodem van de buis om te voorkomen dat er vloeistof spat wanneer u het deksel opent.
6) Annexine V-EGFP en PI zijn lichtgevoelige stoffen. Vermijd daarom blootstelling aan licht tijdens het gebruik.
7) Alleen voor onderzoeksdoeleinden!

Instructies

Experimenteel ontwerp
Lege buis: Negatieve controlecellen zonder Annexin V-EGFP en PI-kleuroplossing werden gebruikt voor spanningsregulatie.
Enkelvoudig gekleurde buizen: Positieve controlecellen, alleen aangevuld met Annexin V-EGFP, werden gebruikt om de compensatie te moduleren.
Detectiebuis: De cellen werden behandeld met Annexin V-EGFP en PI-kleuroplossing. De experimentele gegevens werden verkregen door de parameters van de blanco buis en de enkele kleurstofbuis aan te passen.
1.1 Monsterverven
1) suspensiecel: Cellen werden verzameld door centrifugatie bij 300 g gedurende 5 min bij 4 °C.
aanhangende cel: Na vertering met trypsine zonder EDTA werden de cellen geoogst door centrifugatie bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. De verteringstijd van trypsine mag niet te lang zijn om vals-positieve resultaten te voorkomen.
2) De cellen werden tweemaal gewassen met voorgekoelde PBS, elke keer bij 300 g, en gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 4 ℃.
3) De cellen werden opnieuw gesuspendeerd met 1×bindingsbuffer en de concentratie werd aangepast tot 1~5 ×106/ml.
4) 100 μl celsuspensie werd toegevoegd aan 5 ml flowcytometriebuizen, 5 μl Annexin V-EGFP werd toegevoegd en de cellen werden gemengd en gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder het licht geïncubeerd.
5) Nadat 10 μl PI-oplossing en 400 μl PBS waren toegevoegd, werd de kleuring onmiddellijk uitgevoerd.
[Opmerkingen]: Bij het gebruik van flowcytometrie om apoptose te detecteren, wordt PI sterk beïnvloed door de tijd. Te lange tijd zal leiden tot een toename van PI-kleuring. Daarom moet flowcytometrie binnen 1 uur worden voltooid.
1.2 Flowcytometrie-analyse
De maximale excitatiegolflengte van EGFP was 488 nm en de maximale emissiegolflengte was 507 nm; De maximale excitatiegolflengte van het PI-DNA-complex was 535 nm en de maximale emissiegolflengte was 615 nm. Software zoals CellQuest werd gebruikt voor analyse en er werd een tweekleurige dotplot getekend, EGFP is de abscis en PI is de ordinaat. Verzamel 10.000 gebeurtenissen per monster. In een typisch experiment kunnen de cellen worden verdeeld in drie subgroepen, levende cellen hebben alleen een achtergrondfluorescentie met een zeer lage intensiteit, vroege apoptotische cellen hebben alleen een sterke groene fluorescentie en late apoptotische cellen hebben een groene en rode fluorescentiedubbelkleuring.