Het detectieprincipe van de Annexin V-Alexa Fluor488/PI apoptosedetectiekit is als volgt: in normale levende cellen bevindt fosfatidylserine (PS) zich aan de binnenkant van het celmembraan, maar in vroege apoptotische cellen flipt PS van de binnenkant van het celmembraan naar het oppervlak van het celmembraan en wordt blootgesteld aan de extracellulaire omgeving. Annexin-V is een Ca²⁺ -afhankelijk fosfolipide-bindend eiwit met een moleculair gewicht van 35 tot 36 kD, dat zich met hoge affiniteit aan PS bindt en zich aan het celmembraan van vroege apoptotische cellen bindt via fosfatidylserine dat aan de buitenkant van de cel is blootgesteld.
Bovendien wordt Propidium Iodide (PI) verstrekt om overlevende vroege cellen te onderscheiden van necrotische of laat-apoptotische cellen. PI is een nucleïnezuurkleurstof die niet door het intacte celmembraan van normale cellen of vroeg-apoptotische cellen kan passeren, maar wel door het celmembraan van laat-apoptotische en necrotische cellen en de kern rood kan maken. Dus toen Annexin V werd gecombineerd met PI, werd PI uitgesloten van levende cellen (Annexin V^-/PI^-) en vroege apoptotische cellen (Annexin V⁺/PI^-). Daarentegen waren laat-apoptotische en necrotische cellen dubbelpositief voor Alexa Fluor488 en PI (Annexin V⁺/PI⁺).

Productcomponenten

Verzending en opslag

De componenten worden geleverd met een koelelement en kunnen 1 jaar bij -20°C worden bewaard.

Voorzorgsmaatregelen

1) Omdat apoptose een snel proces is, wordt aanbevolen om monsters binnen 1 uur na kleuring te analyseren.
2) Voor aanhechtende cellen is vertering een cruciale stap. Gebruik geen EDTA in de verteringsoplossing, omdat EDTA de binding van Annexin V aan PS kan beïnvloeden.
3) Als het monster uit bloed komt, zorg er dan voor dat u bloedplaatjes uit het bloed verwijdert. Omdat bloedplaatjes PS bevatten, dat zich kan binden aan Annexin V, wat de resultaten kan verstoren. Een buffermiddel met EDTA kan worden gebruikt en de bloedplaatjes kunnen worden weggespoeld door centrifugatie bij 200 g.
4) Centrifugeer het reagens kort voordat u het deksel opent en giet de vloeistof via de binnenwand van het deksel naar de bodem van de buis om te voorkomen dat er vloeistof spat wanneer u het deksel opent.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 en PI zijn lichtgevoelige stoffen en moeten bij gebruik uit de buurt van licht worden gehouden.
6) Alleen voor onderzoeksdoeleinden!

Instructies

1.1 Monster verven
1.a) suspensiecel: Cellen werden verzameld door centrifugatie bij 300 g gedurende 5 min bij 4°C.
b) aanhangende cel: Na digestie met trypsine zonder EDTA werden cellen geoogst door centrifugatie bij 300 g gedurende 5 min bij 4 °C. De trypsinedigestietijd mag niet te lang zijn om vals-positieve resultaten te voorkomen.
2. De cellen werden tweemaal gewassen met PBS dat vooraf was gekoeld op 4 °C, waarbij telkens 300 g werd gebruikt, en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd op 4 °C.
3. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd door toevoeging van 250 μL 1×Binding Buffer en de concentratie werd aangepast tot 1×106/mL.
4. 100 μL celsuspensie werd toegevoegd aan een 5 ml flowcytometriebuis, 5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488 en 10 μL PI werden toegevoegd en voorzichtig gemengd.
5. De reactie werd beschermd tegen licht en gedurende 15 minuten op kamertemperatuur gehouden.
6. Er werd 400 μL 1×Binding Buffer toegevoegd, gemengd en de monsters werden binnen 1 uur gedetecteerd door middel van flowcytometrie.
[Opmerkingen]: Om celverlies tijdens het wassen van de cellen te voorkomen, kan een kleine tip worden gebruikt om vloeistof op te zuigen.
1.2 Flowcytometrie-analyse
Alexa Fluor488 heeft een maximale excitatiegolflengte van 488 nm en een maximale emissiegolflengte van 519 nm; De maximale excitatiegolflengte van het PI-DNA-complex was 535 nm en de maximale emissiegolflengte was 615 nm. CellQuest en andere software werden gebruikt om een ​​tweekleurige dotplot te analyseren en te tekenen met Alexa Fluor488 als abscis en PI als ordinaat. Verzamel 10.000 gebeurtenissen per monster.
1.3 Fluorescentiemicroscopie-analyse
1) Druppel een druppel van de celsuspensie, dubbel gekleurd met Annexin V-FITC/PI, op het objectglaasje en dek de cellen af ​​met een dekglaasje.
2) Het werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop met een tweekleurenfilter. Het fluorescentiesignaal van Annexin V-FITC was groen en het fluorescentiesignaal van PI was rood.