Wanneer cellen apoptose ondergaan, activeren ze endonuclease-enzymen die het genomische DNA tussen nucleosomen knippen. Nadat DNA tijdens apoptose was geëxtraheerd, kon een DNA-ladder van 180-200 bp worden gevonden.
TUNEL (TdT-gemedieerde dUTP Nick End Labeling) Apoptosedetectiekit (Alexa Fluor 640) kan worden gebruikt om nucleaire DNA-fragmentatie te detecteren in het late apoptotische proces van weefselcellen. Het principe is dat onder de werking van Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), Alexa Fluor 640-12-DUTP wordt opgenomen in de 3´-hydroxyl (3´-OH) Terminal die wordt blootgesteld tijdens de breuk van genomisch DNA. Het kan dus worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie. Alexa Fluor 640 is een rode fluorescerende kleurstof met een hoge stabiliteit en sterke helderheid.
Deze kit heeft een breed scala aan toepassingen en kan worden gebruikt voor het detecteren van apoptose in bevroren of paraffine secties, evenals in gekweekte aanhechtende of gesuspendeerde cellen.

Productcomponenten

Verzending en opslag

De componenten worden geleverd met een koelelement en kunnen 1 jaar bij -20°C worden bewaard.

Voorzorgsmaatregelen

1. Het is noodzakelijk om uw eigen PBS te bereiden voor het wassen van cellen, een anti-fluorescentie-quenching-oplossing voor het sealen van tabletten en 4% paraformaldehyde voor fixatie. Leukocyten moeten mogelijk lange tijd gekweekt worden.
2. Alleen voor onderzoeksdoeleinden!

Instructies

1. De monsterbereiding
1.1 Paraffine ingebedde weefselsecties
1.1.1.De paraffineweefselsecties werden gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur ondergedompeld in xyleen. Dit werd nog een keer herhaald om de paraffine grondig te verwijderen.
1.1.2.Laat de coupes 5 minuten weken in 100% ethanol bij kamertemperatuur en herhaal dit nog een keer.
1.1.3.De monsters werden bij kamertemperatuur gedurende telkens 3 min. gedrenkt in gradiëntethanol (90, 80, 70%).
1.1.4.Spoel de secties voorzichtig met PBS en dep de overtollige vloeistof rond het monster op de glazen objectglaasjes voorzichtig af met filterpapier. In dit geval kan de paraffinepen of hydrofobe pen worden gebruikt om de omtrek van de monsterverdeling rond het monster te tekenen, wat handig is voor de downstream permeabiliteitsverwerking en balanslabeling. Laat het monster niet drogen tijdens het experiment. Doe het verwerkte monster in de natte doos om het monster nat te houden.
1.1.5.2 mg/ml Proteïnase K-oplossing werd verdund met PBS in een verhouding van 1:100 om een ​​uiteindelijke concentratie van 20 μg/ml te bereiken.
1.1.6. Aan elk monster werd 100 μL Proteinase K-oplossing toegevoegd met een concentratie van 20 μg/ml totdat het volledig bedekt was. Vervolgens werd het monster gedurende 20 min. bij kamertemperatuur geïncubeerd.
[Notities]: Proteïnase K helpt weefsels en cellen permeabel te worden voor de kleuringsreagentia in volgende stappen. Een te lange incubatietijd vergroot het risico dat weefselsecties van de dragerplaat vallen in volgende wasstappen, terwijl een te korte incubatietijd kan leiden tot onvoldoende permeabiliteitsbehandeling en de efficiëntie van de labeling kan beïnvloeden. Om betere resultaten te verkrijgen, kan het nodig zijn om de incubatietijd van Proteïnase K te optimaliseren.
1.1.7.Spoel het monster 2-3 keer met PBS-oplossing, verwijder voorzichtig overtollige vloeistof en dep de vloeistof rond het monster op de slide voorzichtig met filterpapier. Het verwerkte monster wordt in een natte doos geplaatst om het monster vochtig te houden.
1.2 Bevroren weefselsectie
1.2.1. Verwijder bevroren secties en breng ze terug naar kamertemperatuur. De slides werden ondergedompeld in 4% paraformaldehyde-oplossing (opgelost in PBS) en gefixeerd en 30 min bij kamertemperatuur geïncubeerd.
1.2.2. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof en dep de overtollige vloeistof voorzichtig rond het monster op het objectglaasje met behulp van filterpapier.
1.2.3. De glaasjes werden ondergedompeld in een PBS-oplossing, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en in totaal nogmaals 2 keer met PBS gewassen.
1.2.4. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof en dep het glasplaatje voorzichtig met filterpapier om overtollige vloeistof rond het monster te verwijderen. In dit geval kan de paraffinepen of hydrofobe pen worden gebruikt om de omtrek van de monsterverdeling rond het monster te tekenen, wat handig is voor de downstream permeabiliteitsverwerking en balanslabeling. Laat het monster tijdens het experiment niet drogen en doe het verwerkte monster in de natte doos om het monster nat te houden.
1.2.5. 2 mg/ml proteïnase K-oplossing werd verdund met PBS in een verhouding van 1:100 om een ​​uiteindelijke concentratie van 20 μg/ml te bereiken.
1.2.6. Aan elk monster werd 100 μL Proteinase K-oplossing met een concentratie van 20 μg/ml toegevoegd totdat het volledig bedekt was. Vervolgens werd het monster gedurende 10 min. bij kamertemperatuur geïncubeerd.
[Notities]: Proteïnase K helpt weefsels en cellen om permeabel te zijn voor kleuringsreagentia in volgende stappen. Een te lange incubatietijd vergroot het risico dat weefselsecties van de dragerplaat vallen in volgende wasstappen, terwijl een te korte incubatietijd kan leiden tot onvoldoende permeabiliteitsbehandeling en de efficiëntie van de labeling kan beïnvloeden. Het kan nodig zijn om de incubatietijd van Proteïnase K te optimaliseren als er geen betere resultaten zijn verkregen.
1.2.7. Spoel het monster 2-3 keer in een open bekerglas met PBS-oplossing.
[Opmerkingen]: Om te voorkomen dat het monster tijdens de reinigingsstap loslaat, wordt aanbevolen om de fles niet te wassen, maar de glasplaatjes 2-3 keer in een PBS-oplossing te weken voor het reinigen.
1.2.8. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof en dep de vloeistof voorzichtig rond het monster op het objectglaasje met behulp van filterpapier.Het verwerkte monster wordt in een natte doos geplaatst om de vochtigheid van het monster te behouden.
1.3 Voorbereiding van het celkruipblad
Adherente cellen werden gekweekt op Lab-Tek Chamber Slides. Na apoptose-inductiebehandeling werden de slides tweemaal gewassen met PBS.
1.4 Voorbereiding van celuitstrijkjes (met polylysine-gecoate preparaten als voorbeeld)
1.4.1. De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in PBS in een concentratie van ongeveer 2×107 cellen/ml, 50-100 μl van de celsuspensie werd opgezogen op met polylysine gecoate objectglaasjes en de celsuspensie werd voorzichtig opengespreid met een schoon objectglaasje.
1.4.2. De cellen werden gefixeerd en de glaasjes werden ondergedompeld in een kleuringstank met 4% vers bereide paraformaldehyde in PBS en gedurende 25 minuten op 4 °C geplaatst.
1.4.3. De glaasjes werden gewassen, ondergedompeld in PBS en 5 min. bij kamertemperatuur bewaard. Opnieuw wassen met PBS.
1.4.4. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof en dep het glasplaatje voorzichtig met filterpapier om overtollige vloeistof rond het monster te verwijderen. In dit geval kan een paraffinepen of hydrofobe pen worden gebruikt om de verdeling van het monster rond het monster te schetsen om de downstream permeabiliteitsverwerking en balance labeling-bewerkingen te vergemakkelijken. Laat het monster tijdens het experiment niet drogen en doe het verwerkte monster in de natte doos om het monster nat te houden.
1.4.5. 2 mg/ml Proteinase K-oplossing werd verdund met PBS in een verhouding van 1:100 om een ​​uiteindelijke concentratie van 20 μg/ml te bereiken.
1.4.6. Aan elk monster werd 100 μl proteïnase K-oplossing met een concentratie van 20 μg/ml toegevoegd om het volledig te bedekken en gedurende 5 min bij kamertemperatuur te incuberen (het kan ook worden ondergedompeld in een 0,2% Triton X-100-oplossing bereid in PBS en gedurende 5 min bij kamertemperatuur worden geïncubeerd voor permeabiliteitsbehandeling).
[Notities]: Proteïnase K helpt weefsels en cellen om permeabel te zijn voor kleuringsreagentia in volgende stappen. Een te lange incubatietijd vergroot het risico dat weefselsecties van de dragerplaat vallen in volgende wasstappen, terwijl een te korte incubatietijd kan leiden tot onvoldoende permeabiliteitsbehandeling en de efficiëntie van de labeling kan beïnvloeden. Het kan nodig zijn om de incubatietijd van Proteïnase K te optimaliseren als er geen betere resultaten zijn verkregen.
1.4.7. Spoel het monster 2-3 keer met PBS, verwijder voorzichtig overtollige vloeistof en dep de vloeistof rond het monster op de slide voorzichtig met filterpapier. De verwerkte monsters werden in een natte doos geplaatst.
2. Stappen voor DNase-behandeling van positieve controles
Na permeatie van het monster, cellen werden behandeld met DNase I om positieve controleslides te bereiden. Dit proces zorgt er doorgaans voor dat de meeste cellen behandeld om groene fluorescentie te tonen.
[Opmerkingen]: Behandeling van geïmmobiliseerde cellen met DNA-I veroorzaakt breuk van chromosomaal DNA, waardoor er veel 3'-uiteinden van DNA ontstaan ​​die gelabeld kunnen worden.
2.1. Verdun 10×DNase I Buffer met gedemineraliseerd water in een verhouding van 1:10 (200 µL 1× DNase I Buffer is vereist voor elk monster, dat wil zeggen, 20 µL 10× DNase I Buffer en 180 µL gedemineraliseerd water zijn vereist voor verdunning). Een druppel van 100 µl werd toegevoegd aan het permeabele monster en gedurende 5 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Voeg 1 µL DNase I (1U/µL) toe aan de resterende 100 µL 1×DNase I Buffer om een ​​uiteindelijke concentratie van 10 U/mL te bereiken.
2.2.De vloeistof werd voorzichtig afgeklopt, waarna 100 μL buffer met 10 U/ml DNase I werd toegevoegd en het geheel 10 min bij kamertemperatuur werd geïncubeerd.
2.3. Tik op het objectglaasje om overtollige vloeistof te verwijderen en was het objectglaasje grondig 3-4 keer in een kleurstoftank met gedemineraliseerd water.
[Opmerkingen]: Er moet een aparte kleuringstank worden gebruikt voor de positieve controleglaasjes, anders kan resterend DNase I op de positieve controleglaasjes een hoge achtergrond op de experimentele glaasjes veroorzaken.
3. Etikettering en detectie
3.1.Equilibratiebuffer (5 x Equilibratiebuffer) wordt verdund met gedemineraliseerd water in een verhouding van 1:5 (100 μL 1 x Equilibratiebuffer is vereist voor elk monster).
3.2. Equilibratiebuffer (100 μL 1×Equilibratiebuffer) werd aan elk monster toegevoegd om het gebied volledig te equilibreren en gedurende 10-30 min bij RT geïncubeerd. U kunt het ook in een vat met 1 x Equilibratiebuffer schuiven om ervoor te zorgen dat de slides het monster niet equilibreren. Ontdooi Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix op ijs terwijl u de cellen in evenwicht brengt en bereid voldoende TdT-incubatiebuffer voor alle experimenten en optionele positieve controlereacties volgens Tabel 1. Voor een standaardreactie met een oppervlak van minder dan 5 cm2 is het volume 50 μl en wordt 50 μL vermenigvuldigd met het aantal experimentele en positieve controlereacties om het totale volume van de vereiste TdT-incubatiebuffer te bepalen. Voor monsters met grotere oppervlakken kan het reagensvolume proportioneel worden verhoogd.

Tabel 1. TdT-incubatiebuffers bereid voor experimenten en optionele positieve controlereacties

[Negatief controlesysteem]: Er werd een controle-incubatiebuffer zonder het TdT-enzym bereid en het TdT-enzym werd vervangen door ddH2O.
3.3. Het grootste deel van de 100 μL 1×Equilibration Buffer werd weggespoeld met absorberend papier rond het geëquilibreerde gebied en vervolgens werd 50 μLTdT incubatiebuffer toegevoegd aan een 5 cm2 gebied van cellen. Laat de cellen niet uitdrogen. Hierna moet de slide worden afgeschermd van licht.
3.4. Plaats een plastic dekglaasje over de cellen om een ​​gelijkmatige verdeling van de reagentia te garanderen, en plaats een papieren handdoek bevochtigd met water op de bodem van de natte doos. De slides werden in een natte doos geplaatst en gedurende 60 min. bij 37 ° C geïncubeerd. Wikkel de natte doos in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.
[Opmerkingen]: Het plastic afdekglas kan voor gebruik doormidden worden gesneden. Vouw de rand van het afdekglas om voor eenvoudig verwijderen en manipuleren.
3.5. De plastic dekglaasjes werden verwijderd en de secties werden 5 min. bij kamertemperatuur in PBS-oplossing geïncubeerd. Vervolgens werden de secties tweemaal gewassen met verse PBS.
3.6. Veeg de PBS-oplossing voorzichtig rond en op de achterkant van het monster met filterpapier.
[Opmerkingen]: Om de achtergrond te verminderen, kunnen de glaasjes na eenmaal wassen met PBS, driemaal worden gewassen met PBS met 0,1% Triton X-100 en 5 mg/ml BSA, telkens gedurende 5 minuten, zodat de vrije, niet-gereageerde markers helder en schoon zijn.
3.7. Monsters werden gekleurd in een kleuringstank en de objectglaasjes werden ondergedompeld in een kleuringstank met PI-oplossing (1 μg/ml, vers bereid en verdund met PBS) in het donker en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bewaard. (Optioneel): Monsters werden gekleurd in een kleuringstank en de objectglaasjes werden ondergedompeld in een kleuringstank met DAPI-oplossing (2 μg/ml, vers bereid en verdund met PBS) in het donker en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bewaard.
3.8.Was het monster, dompel de slide onder in gedemineraliseerd water en laat het 5 minuten op kamertemperatuur staan. Herhaal dit twee keer voor in totaal drie wasbeurten.
3.9. Het overtollige water op het objectglaasje werd drooggeslagen en er werd 100 μl PBS aan het monstergebied toegevoegd om het monster vochtig te houden.
3.10. Monsters werden onmiddellijk geanalyseerd onder een fluorescentiemicroscoop, Alexa Fluor 640 rode fluorescentie werd gedetecteerd bij 620 nm en blauwe DAPI werd waargenomen bij 460 nm. DAPI kon zowel apoptotische als niet-apoptotische cellen blauw kleuren, en alleen in apoptotische kernen werd Alexa Fluor 640-12-dUTP opgenomen en gelokaliseerde rode fluorescentie. Indien nodig kunnen de slides 's nachts bij 4 ° C in het donker worden bewaard.
4. De suspensiecellen werden gedetecteerd door middel van flowcytometrie
4.1. 3~5×106 cellen werden tweemaal gewassen met PBS door centrifugatie (300×g) bij 4 ° C, gecentrifugeerd bij 300 g bij 4 ° C gedurende 10 min en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 0,5 ml PBS.
4.2. De cellen werden gefixeerd en er werd 5 ml van een 1% paraformaldehyde-oplossing, bereid in PBS, toegevoegd en gedurende 20 minuten op ijs gezet.
4.3. Cellen werden gecentrifugeerd bij 300 × g bij 4 °C gedurende 10 min, en de supernatant werd verwijderd en geresuspendeerd in 5 ml PBS. De wasbeurt werd eenmaal herhaald en de cellen werden geresuspendeerd met 0,5 ml PBS.
4.4. De cellen werden doordrongen en 5 ml met ijs voorgekoelde 70% ethanol werd toegevoegd en gedurende 4 uur bij -20 °C geïncubeerd. De cellen konden een week in 70% ethanol bij -20℃ worden bewaard, of de cellen konden doordringbaar worden gemaakt met 0,2% Triton X-100-oplossing bereid in PBS en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur worden bewaard.
4.5. Cellen werden gecentrifugeerd bij 300 × g gedurende 10 min en geresuspendeerd in 5 ml PBS. Centrifugatie werd herhaald en geresuspendeerd in 1 ml PBS.
4.6. Breng 2 × 106 cellen over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
4.7. Equilibratie werd gecentrifugeerd bij 300 × g gedurende 10 min, en de supernatant werd verwijderd en geresuspendeerd met 80 μL 1 × Equilibration Buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
4.8. Tijdens het balanceren van cellen werd Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix op ijs gesmolten en werd een voldoende hoeveelheid TdT-incubatiebuffer voor alle reacties bereid volgens Tabel 1. Voor een standaardreactie van 2 × 106 cellen was het volume 50 μL en werd 50 μL vermenigvuldigd met het aantal reacties om het totale volume van de vereiste TdT-incubatiebuffer te bepalen.
4.9. De cellen werden 10 min gecentrifugeerd bij 300 × g, de supernatant werd verwijderd en het precipitaat werd geresuspendeerd in 50 μL TdT incubatiebuffer en 60 min geïncubeerd bij 37℃, afgeschermd van licht. Cellen werden elke 15 min voorzichtig geresuspendeerd met een micropipet.
4.10. De reactie werd beëindigd door 1 ml 20 mM EDTA toe te voegen en voorzichtig te mengen met een micropipet.
4.11. Na centrifugatie bij 300g gedurende 10 min werd de supernatant weggegooid en werd het precipitaat opnieuw gesuspendeerd in 1 ml 0,1% Triton X-100-oplossing bereid in PBS, met 5 mg/ml BSA. De oplossing werd eenmaal herhaald en in totaal tweemaal gewassen.
4.12. Cellen werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie en de rode fluorescentie van Alexa Fluor 640 bij 620 nm werd gemeten.