Polybrene (hexadimethrine bromide), ook bekend als Polybrene, is een kationisch polymeer dat veel wordt gebruikt in DNA-transfectie-experimenten met zoogdiercellen om de transfectie-efficiëntie van liposomen te verbeteren. Het wordt veel gebruikt in retrovirus-gemedieerde gentransfectie en lentivirus-gemedieerde gentransfectie. Het werkingsmechanisme kan het neutraliseren van het siaalzuur op het celoppervlak omvatten, waardoor adsorptie wordt vergemakkelijkt door elektrostatische afstoting met virusdeeltjes te overwinnen. Polybrene wordt ook erkend als een anticoagulans (heparine-antagonist) en wordt vaak gebruikt bij de productie van niet-specifiek geaggregeerde rode bloedcellen. Bovendien is aangetoond dat lage doses Polybrene bij eiwitsequencing de afbraak van peptiden in geautomatiseerde sequentieanalyse aanzienlijk verbeteren. De toevoeging van Polybrene aan PVDF-membranen kan ook de membraanaffiniteit verbeteren.

Specificatie

Het product wordt geleverd in oplossingsvorm en het poeder wordt gereconstitueerd in 0,9% NaCl om een ​​10 mg/ml oplossing te maken, die vervolgens wordt gesteriliseerd met een 0,22 μm filter. Het wordt doorgaans verdund in een verhouding van 1:1000-1:2000 voor gebruik, met specifieke verdunningsverhoudingen afhankelijk van het celtype, zoals uiteengezet in relevante literatuur.

Verzending en opslag

Transport en opslag worden aanbevolen bij -20 ºC, met een houdbaarheid van 2 jaar. Het wordt aangeraden om te aliquoteren en op te slaan om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.

Voorzorgsmaatregelen:

1. Draag laboratoriumkleding en wegwerphandschoenen voor uw veiligheid en gezondheid.

2. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.

Operationele stappen

(ter referentie, specifieke concentraties kunnen variëren, raadpleeg de relevante literatuur):

Let op: Polybrene kan een aanzienlijke toxiciteit vertonen voor bepaalde cellen (zoals terminaal gedifferentieerde neuronen, DC-cellen). Voor het eerste gebruik wordt een toxiciteitstest aanbevolen.

Experiment 1: Retrovirale infectie

1. Bereiding van recombinant retrovirus stock: kweek cellen die een monolaag van transfectie retrovirus verpakkingscellen bevatten in een 100 mm schaal met 5 ml groeimedium (5% serum). Verwijder na 24 uur het kweekmedium en filtreer het door een 0,45 μm filter.

2. Cellen kweken voor infectie: Voeg in een schaal van 100 mm 10 ml compleet groeimedium toe met een celdichtheid van 5×10⁵ per gerecht.

3. Virusinfectie: Verwijder na 24 uur celkweek het volledige kweekmedium. Infecteer cellen met 2 ml virussupernatant met Polybrene (eindconcentratie: 5-10 μg/ml) bij 37°C gedurende 3-6 uur.

4. Verzamel virusdeeltjes: Voeg 8 ml compleet groeimedium toe. Verzamel na 2-3 dagen cultuur het kweekmedium om virusdeeltjes te verkrijgen.

Experiment 2: Transfectie

1. Kweek de cellen in volledig groeimedium met een celdichtheid van ongeveer 50%.

2. Bereid na 18-24 uur celkweek een DNA-groeimedium-Polybrene-mengsel. Voeg compleet groeimedium toe (2 ml voor een 60 mm schaal, 3 ml voor een 100 mm schaal) en verwarm voor tot 37 °C. Meng voorzichtig 10 ng~10 µg plasmide. Voeg Polybrene toe tot een uiteindelijke concentratie van 5-10 μg/mL. Meng voorzichtig. Elk component moet in de aangegeven volgorde worden toegevoegd.

3. Verwijder het kweekmedium en voeg de DNA-groeimedium-Polybrene-oplossing toe aan de cellen bij 37°C gedurende 6-20 uur. Meng voorzichtig elke 1,5 uur binnen de eerste 6 uur van de celkweek.

4. Verwijder de DNA-groeimedium-Polybrene-oplossing. Bedek cellen met DMSO-schokoplossing (15% DMSO in 1× HBSS).Schud de kweekschaal voorzichtig gedurende 10 seconden elke keer dat de oplossing wordt toegevoegd om een ​​gelijkmatige verdeling te garanderen. Incubeer cellen bij 37°C gedurende 4 minuten.

5. Verwijder onmiddellijk de DMSO-schokoplossing en was de cellen voorzichtig tweemaal met volledig groeimedium. Voor een 60 mm schaal, was elke keer met 5 ml kweekmedium en voor een 100 mm schaal, was elke keer met 10 ml kweekmedium.

6. Voeg volledig groeimedium toe aan de cellen.

7. Eiwitexpressie: Verzamel na 24-72 uur kweek de cellen voor analyse van de eiwitexpressie, indien nodig.

Celselectie: Na 24-72 uur cultuur, afhankelijk van de celstatus, schakelt u over op vers selectiemedium en gaat u verder met celselectie.