Vero De Host Cell DNA Residue Detection Kit wordt gebruikt voor de kwantitatieve analyse van Vero-gastcel-DNA-residuen in tussenliggende monsters, halffabricaten en eindproducten van verschillende biologische producten.

Deze kit maakt gebruik van Taqman fluorescent probe en de polymerase chain reaction (PCR) methode, die een fg level minimum detectielimiet heeft en specifiek en snel het residuale Vero cel DNA kan detecteren. De kit moet samen met de Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat# 18461ES) worden gebruikt.

Product Componenten

^*IC：Interne controle

Verzending en opslag

1. Verzonden op droogijs en bewaard bij -20°C voor 2 jaar

2. Controleer de goederen na ontvangst en bewaar ze direct bij de juiste opslagtemperatuur.

Voorzorgsmaatregelen

1. Lees deze handleiding zorgvuldig door voordat u dit reagens gebruikt. Het experiment moet worden gestandaardiseerd, inclusief de monsterbehandeling, de voorbereiding van het reactiesysteem en het toevoegen van monsters.

2. Het toevoegen van monsters en het bereiden van oplossingen kan het beste op ijs gebeuren.

3. Zorg ervoor dat elk onderdeel volledig wordt gewerveld en op lage snelheid wordt gecentrifugeerd voordat u het gebruikt.

4. Voor uw veiligheid en gezondheid verzoeken wij u om tijdens de operatie een labjas en wegwerphandschoenen te dragen.

5. Dit product is ALLEEN bedoeld voor onderzoeksdoeleinden!

Toepasbare instrumentmodellen

Omvatten onder meer:

Bio-Rad: CFX96 optische module.

Thermowetenschappelijk: ABI-waarde 7500; ABI Quant Studio 5; ABI-stap OnePlus.

Gebruik van instructies

1. Vero DNA-standaardverdunning en standaardcurvevoorbereiding

De Vero DNA-controle werd gradiëntverdund met behulp van de DNA-verdunningsbuffer die in de kit werd meegeleverd, en de verdunningsconcentratie is 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Zie onderstaande gedetailleerde instructies:

1.1 Ontdooi de Vero DNA-controle en DNA-verdunningsbuffer op ijs. Nadat het volledig is ontdooid, schudt u het voorzichtig om het te mengen en centrifugeert u het op lage snelheid gedurende 10 seconden.

1.2 Haal er zes uit schone 1,5 ml-buisjes, gemarkeerd met 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Voeg 90 μL DNA-verdunningsbuffer en 10 μL Vero toe DNA-controle naar de 1.5 ml microfugebuis met label 3 ng/μL, en verdun tot 3 ng/μL. Meng en centrifugeer vervolgens gedurende 10 seconden. Verpak de verdunde DNA-standaard in subverpakkingen en deze kan op korte termijn (niet langer dan 3 maanden) bij -80°C worden bewaard. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.

1.4 Voeg 90 μL DNA-verdunningsbuffer toe aan andere buizen, volg dan de onderstaande procedure voor de seriële verdunningen.

[Notities]:

1. Voor elke concentratie zijn drie replica-wells vereist. Het detectiebereik is 3 fg/μL-300pg/μL En Indien nodig kan dit bereik worden uitgebreid.

2. Om het aantal herhaalde invries-ontdooiingen te verminderen en besmetting te voorkomen, wordt aanbevolen om de DNA-controle op te slaan voor het eerst in alikwoten bij -80°C.

3. Eenmaal ontdooid kan de DNA-verdunningsbuffer bewaard worden bij 2-8°C gedurende 7 dagen, indien langere tijd niet gebruikt, bewaren bij -20°C.

4. Zorg ervoor dat het sjabloon volledig gemengd is, schud het mengsel voorzichtig gedurende 15 seconden tot 1 minuut voor elke gradiëntverdunning.

2. Extraction Recovery Control (ERC) voorbereiding

Stel de concentratie in van Vero DNA in ERC indien nodig (het ERC-monster werd bereid met 3 pg/μL DNA als voorbeeld), als volgt:

2.1 Voeg 100 μL testmonster toe aan een schone 1,5 ml-buis en voeg vervolgens 10 μL 3 pg/μL Vero toe DNA-standaard (③) en goed mengen, gemarkeerd als ERC.

2.2 Voer de DNA-extractie van het ERC-monster uit samen met de testmonsters om de gezuiverde ERC te bereiden steekproef.

3. Voorbereiding van positieve controlemonsters (PCS) (optioneel)

Stel de concentratie in van Vero DNA in PCS indien nodig (de PCS werd bereid met 3 pg/μL DNA als voorbeeld), als volgt:

3.1 Voeg 100 μL 3 pg/μL Vero toe DNA-standaard (③) in een schone 1,5 ml-buis en markeer dit met PCS.

3.2 Voer de DNA-extractie van PCS uit samen met de testmonsters om het gezuiverde PCS te bereiden.

4. Negatief Voorbereiding van de controleoplossing (NCS)

Stel de negatieve controle in het experiment in; de specifieke bewerkingsstappen zijn als volgt:

4.1 Voeg 100 μL toe monstermatrix (of DNA-verdunningsbuffer) in een schone 1,5 ml-buis en markeer deze vervolgens als NCS.

4.2 Voer de DNA-extractie uit van het NCS-monster samen met de testmonsters om het gezuiverde NCS-monster voor te bereiden.

5. Geen Template Control (NTC) voorbereiding

Stel de geen sjabloon in controle in het experiment, zijn de specifieke operationele stappen als volgt:

5.1 NTC vereist geen voorbehandeling van het monster en kan worden geconfigureerd in de fase van qPCR-detectie van rest-DNA-inhoud.

5.2 Het NTC-monster in elke buis of put is 20 μL Mix (d.w.z. 16 μL Vero qPCR-mix + 4 μL Vero Primer&probe-mix) + 20 μL DNA-verdunningsbuffer. Het wordt aanbevolen om drie replicaatputten te configureren.

6. PCR-reactiesysteem

[Notities]:

1. Bereken het totale PCR-reactievolume door het aantal reacties: qPCR-mix = (het aantal reacties + 2) × (16 + 4) μL (inclusief de verliezen van twee reactieputjes). In het experiment worden meer dan drie replicaties voor elk monster aanbevolen.

2. Na het afsluiten van de buis of het verzegelen van de plaat, centrifugeer de reactiebuis of plaat op lage snelheid gedurende 10 seconden. Na voldoende schudden en mengen gedurende 5 seconden, herhaal de centrifuge om de vloeistof van het deksel of de wand naar de bodem te verzamelen. Vermijd bellen tijdens de werking.

Zie onderstaande tabel voor de aanbevolen plaatopstelling:

De plaatindeling omvat: 1 NTC (geen sjabloon controle), 1 NCS (negatieve controle oplossing), 6 STD (de standaardcurve van 6 standaardconcentraties), 3 TS (testmonsters), 3 ERC (extractieherstelcontrole), 1 PCS (positief controlemonster).Drie replicaatputjes voor elk monster.

7. Richtlijnen voor het instellen van een PCR-instrument (2-stappenmethode)

De volgende instructies zijn alleen van toepassing op het Thermo ABI 7500 qPCR-instrument (Softwareversie 2.0). Als u een ander instrument gebruikt, raadpleeg dan de handleiding van het desbetreffende instrument voor installatierichtlijnen.

7.1 Genereer een nieuw experiment, kies de sjabloon voor absolute kwantificering of door de gebruiker gedefinieerd.

7.2 Voeg in de interface 'Definiëren' en het deelvenster 'Doelen' een doel toe en noem het FAM. Kies 'FAM' als reporter en 'geen' als quencher.

7.3 Voeg in het deelvenster 'Samples' alle informatie over de samples op hun beurt toe. Selecteer vervolgens de wells, kies het doel en de samples dienovereenkomstig. Stel de taak van Vero in DNA-standaard als standaard, en wijs de waarden 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 toe (de eenheid van DNA-concentratie in elke put is fg/μL) in de kolom Hoeveelheid en noem de putten STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, overeenkomstig. Stel de taak van NTC in als NTC. Stel de NCS, TS, ERC in en PCS als Onbekend, en noemde ze overeenkomstig de bovenstaande Plaatindeling. Klik vervolgens op Volgende.

7.4 Stel het amplificatieprogramma in: stel het reactievolume in op 40 μL.

8. Analyse van qPCR-resultaten

8.1 Het systeem geeft automatisch de Threshold in het Amplification Plot-paneel van Analysis. De Threshold die door het systeem wordt gegeven, ligt soms te dicht bij de basislijn, wat resulteert in een groot verschil in Ct tussen replicatenputten. U kunt de Threshold handmatig aanpassen naar een geschikte positie en op Analyze klikken. Vervolgens kunt u eerst controleren of de amplificatiecurve normaal is in Multicomponent Plot.

8.2 Bekijk in het tabblad Resultaatanalyse de Standard Curve-plot. Controleer de waarden voor de helling, Y-intercept, R2 en Efficiëntie. Voor een normale standaardcurve, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 In de 'Bekijk goed tabel' paneel in Analyse, de concentraties van elk monster worden weergegeven in Hoeveelheid, de eenheid is fg/μL, de eenheden kunnen worden omgezet naar pg/μL of pg/mL in het assayrapport.

Handleidingen