Er wordt gebruik gemaakt van de replicatie-competente Lentivirus (RCL) Detection Kit om kwantitatief replicerende lentivirussen te detecteren die kan voorkomen in een verscheidenheid aan celproducten geassocieerd met lentivirale vectoren potentiële risico's.

Deze kit ontwerpt specifieke primers voor de VSV-G-gensequentie van lentivirale envelopproteïnen. En het neemt taqman aan  fluorescerende sonde en de polymerasekettingreactie (PCR)-methode, die een detectielimiet van 1 kopie/μL heeft en kan specifiek en snel detecteren het replicatie-competente lentivirusrisico. De kit heeft te gebruiken samen met de Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat# 18461ES).

Componenten

* Ik： Intern controle.

Opslag

Dit product moet worden bewaard bij -25~-15℃ voor 2 jaren.

Zowel 41311-A als 41311-B moeten op een lichtbeschermde plaats worden bewaard.

Van toepassing instrument modellen

Omvatten onder meer: Bio-Rad: CFX96 optische module; Thermo Scientific: ABI-waarde 7500; ABI Quant Studio 5; ABI-stap OnePlus.

Instructies

1. RCL-DNA Standaard verdunning En Standaard kromme voorbereiding

De RCL DNA-controle werd gradiëntverdund met behulp van de DNA-verdunningsbuffer die in de kit is meegeleverd* , en de verdunning concentratie is 5×10E7 kopieën/μL, 5×10E6 kopieën/μL, 5×10E5 kopieën/μL, 5×10E4 kopieën/μL, 5×10E3 kopieën/μL, 5×10E2 kopieën/μL, 5×10E1 kopieën/μL.

Zie onderstaande gedetailleerde instructies:

1) Ontdooi de RCL DNA-controle en de DNA-verdunningsbuffer op ijs. Na volledig ontdooid te zijn, zachtjes wervelen naar mengen, en centrifugeer op lage snelheid gedurende 10 sec.

2) Neem zeven schone 1,5 ml-buisjes, gemarkeerd met Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6.

3) Voeg 90 toe μL DNA-verdunningsbuffer en 10 μL RCL DNA-controle in de 1,5 ml microfugebuis met het label Std0, namelijk   verdunnen tot 5×10E7 kopieën/μL. Meng en Centrifugeer vervolgens 10 seconden. Verpak de verdunde DNA-standaard in subverpakkingen en het kan op korte termijn (niet langer dan 3 maanden) bewaard bij -25~-15℃** Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.

4) Voeg 90 toe μL DNA-verdunningsbuffer in andere buizen*** , volg dan de onderstaande procedure voor de seriële verdunningen**** .

Tabel 1 Standaardgradiëntverdunning

*Drie repliceren putten Zijn vereist voor elk concentratie.De detectie bereik is 5×10E1 kopieën/μL~5×10E6 kopieën/μL En dit bereik kan zijn indien nodig uitgebreid.

** Naar verminderen de nummer van herhalen vriezen-ontdooien En voorkomen besmetting, het is aanbevolen naar winkel de DNA controle in alikwoten bij -25~-15℃ voor de Eerst tijd.

*** Eenmaal ontdooid, DNA verdunning buffer zou kunnen zijn opgeslagen bij 2-8°C voor 7 dagen, indien niet gebruikt voor A lang tijd, alstublieft winkel bij -25~-15℃ .

**** Maken Zeker de sjabloon is volledig gemengd, zachtjes schudden de mengsel voor 15 seconden naar 1 minuut voor elk gradiënt verdunning.

2. Extractie Herstel Controle (ERC-onderzoek) voorbereiding

Stel de concentratie van RCL-DNA in ERC in zoals nodig (het ERC-monster werd bereid met 5×10E4 kopieert RCL-DNA als een voorbeeld), als volgt:

1) Voeg 100 toe μL testmonster in een schone 1,5 ml-buis en voeg vervolgens 10 μL 5×10E3 kopieën/μL RCL DNA-standaard (Std4) en goed mengen, gemarkeerd als ERC.

2) Voer de DNA-extractie van het ERC-monster uit samen met de testmonsters om het gezuiverde ERC-monster te bereiden.

3. Negatieve controle Oplossing (NCS-) voorbereiding

Stel de negatieve controle in het experiment in; de specifieke bewerkingsstappen zijn als volgt:

1) Voeg 100 toe μL monstermatrix (of DNA-verdunningsbuffer) in een schone 1,5 ml-buis en markeer vervolgens als NCS-onderzoek.

2) Voer de DNA-extractie van NCS uit monster samen met de testmonsters om de gezuiverde NCS te bereiden steekproef.

4. Geen sjabloon Controle (NTC-nummer) voorbereiding

Stel de 'geen sjabloon'-controle in het experiment in; de specifieke bewerkingsstappen zijn als volgt:

1) NTC vereist geen voorbehandeling van het monster en kan worden geconfigureerd in de fase van qPCR-detectie van resterend DNA inhoud.

2) Het NTC-monster in elke buis of put is 20 μL Mix (d.w.z. 15 μL RCL qPCR-mix + 4 μL RCL Primer en sonde Mengen + 1 μL IC) + 10 μL DNA-verdunningsbuffer. Het wordt aanbevolen om drie replicaatputten te configureren.

5. PCR reactie systeem

Tabel2 Reactiesysteem

* Berekenen de totaal PCR reactie volume door de nummer van reacties: qPCR Mengen =(de nummer van reacties+2) × (15+4+1) μL (inclusief de verliezen van twee reactieputjes). Er worden meer dan drie replicaties voor elk monster aanbevolen in het experiment.

** Na afdekken de buis of verzegeling de plaat, centrifuge de reactie buis of bord bij laag snelheid voor 10 seconden. Na voldoende schudden En mengen voor 5 seconden, herhalen centrifuge naar verzamelen de vloeistof van de deksel of muur naar de onderkant. Vermijd bubbels tijdens operatie.

Zie onderstaande tabel voor de aanbevolen plaatopstelling:

Tabel 3 Computer-aan referentie bord

De plaatindeling omvat: 6 Std (de standaardcurve van 6 standaardconcentraties), 1 NTC (geen templatecontrole), 1 NCS (negatieve controleoplossing), 3 TS (testmonsters), 3 ERC (extractieherstelcontrole).Drie replicatieputten voor elk monster.

6. Richtlijnen voor installatie voor A PCR Instrument

De volgende instructies zijn alleen van toepassing op Thermisch ABI 7500 qPCR-instrument (software versie 2.0). Als je gebruikt een Voor verschillende instrumenten raadpleegt u de handleiding van het desbetreffende instrument voor richtlijnen voor de installatie.

1) Genereer een nieuw experiment, kies de sjabloon van absolute kwantificering of door de gebruiker gedefinieerd.

2) Maak 1 detectiesonde, genaamd "RCL-DNA", selecteer reporterfluorofoor als "FAM" en blusfluorofoor als "geen"; maak nog 1 detectiesonde, noem "IC" en selecteer de reporterfluorofoor als "CY5" en blus fluorofoor als "geen". De referentiefluorescentie is ROX" (de referentiefluorescentie kan gebaseerd zijn op de instrumentmodel, enz., selecteer of (je moet het toevoegen).

3) In de Paneel 'Samples', voeg alle informatie over de samples op hun beurt toe. Selecteer vervolgens de wells, kies het doel en de monsters overeenkomstig. Instellen de taak van RCL DNA-standaard als standaard, en wijs de waarden 5000000, 500000, 50000, 5000, 500, 50 (de eenheid van DNA-concentratie in elke well is kopieën/μL) in de kolom Hoeveelheid en noem de  putten Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, overeenkomstig. Stel de taak van NTC als NTC. Stel de NCS, TS en ERC in als Onbekend, en ze kregen hun naam overeenkomstig de bovenstaande plaatindeling. Klik dan op Volgende.

4) Stel het amplificatieprogramma in: stel het reactievolume in op 30 μL.

Tabel4 Versterkingsprocedure

7. Analyse van qPCR resultaten

1) Het systeem zal automatisch de drempelwaarde in de Versterkingsplotpaneel van Analyse. De drempel gegeven doordat het systeem soms te dicht bij de basislijn ligt, wat resulteert in een groot verschil in Ct tussen replicaatputjes. U kunt handmatig aanpassen de drempel naar een geschikte positie en klik Analyseren. Dan kun je in eerste instantie controleren of de amplificatiecurve normaal is in een Multicomponent Plot.

2) In het resultaat Tabblad Analyse, bekijk de grafiek van de standaardcurve. Controleer de waarden voor de R2, Efficiëntie, Helling en Y-intercept. Voor een normale standaardcurve, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Slope≤-3,1.

3) In de 'Weergave goed tafelpaneel in Analyse, de concentraties van elk monster worden weergegeven in Hoeveelheid, de eenheid is kopieën/μL, de eenheden kunnen in het assayrapport worden omgezet.

4) De parameterinstellingen van de resultatenanalyse moet gebaseerd zijn op het specifieke model en de software versie gebruikt en kunnen doorgaans automatisch door het instrument worden geïnterpreteerd.

5) Bereken de piekherstelsnelheid op basis van de testresultaten van het voorbeeld TS te meten en de monsterpiek herstel ERC, het herstelpercentage van spikes zijn vereist tussen 50%~150% liggen. Formule voor piekherstelmeter:

Herstel (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Elutievolume (μL) / Theoretisch waarde van DNA-toevoegingshoeveelheid (bijv. kopieën) x 100%。

6) De Ct waarde van de negatieve controle NCS moet groter zijn dan het gemiddelde van de laagste concentratie Ct van de standaard.

7) Sjabloon gratis controle NTC moet Onbepaald of Ct zijn waarde ≥38.

Notities

1. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.
2. Voor uw eigen veiligheid draagt ​​u een labjas en wegwerphandschoenen.

3. Lees deze handleiding zorgvuldig door voordat u het apparaat gebruikt. dit reagens, en het experiment moet gestandaardiseerd worden, inclusief monsterbehandeling, voorbereiding van het reactiesysteem en voorbeeld optellen.

4. Zorg ervoor dat elk onderdeel volledig wordt gevortexed en op lage snelheid wordt gecentrifugeerd voordat u het gebruikt.

Handmatig