Reactive Oxygen Species Assay Kit gebruikt het celpermeantreagens 2',7'-dichlorofluorescin diacetaat (DCFDA) om reactieve zuurstofspecies in levende celmonsters kwantitatief te beoordelen. De lipofiele niet-fluorescerende DCFDA passeert gemakkelijk het celmembraan door passieve diffusie gevolgd door deacetylering. Het gedeacyleerde product is een oxidantgevoelige 2',7'-dichlorofluoresceïne (DCHF). DCHF wordt later geoxideerd door ROS om DCF te vormen. DCF is sterk fluorescerend en wordt gedetecteerd door fluorescentiespectroscopie of flowcytometrie met excitatie/emissie bij 480 nm/525 nm. Rosup, een samengesteld mengsel, is een ROS-inductor en kan worden gebruikt als positieve controle.

Productcomponenten

Verzending en opslag

Deze kit wordt geleverd met een ijszak. Bewaar bij -20°C zonder licht gedurende 1 jaar. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.

Toepassingsmethode

1. Reagensbereiding
DCFH-DA-oplossing: Kort centrifugeren op lage snelheid voor het openen. Bereid een werkende DCFH-DA-oplossing voor door 10 mM DCFH-DA te verdunnen in serumvrij medium om een ​​uiteindelijke concentratie van 10 μM te maken.
[Opmerking]: DCFH-DA kan ook worden verdund in media zonder fenolrood. Gebruik vers bereide DCFH-DA-oplossing, langdurige opslag van verdunde DCFH-DA wordt niet aanbevolen. De exacte concentratie van DCFH-DA die nodig is, is afhankelijk van de gebruikte cellijn, maar een algemeen startbereik zou 10-50 μM zijn. Voor bepaalde cellen, als de fluorescentie van de negatieve controle (zonder DCFH-DA-sonde) erg sterk is, verdun DCFH-DA dan tot 2-5 μM en verkort de incubatietijd op passende wijze.
Rosup-oplossing: Bereid een 100 µM Rosup-werkoplossing voor door 100 mM Rosup-voorraadoplossing te verdunnen in serumvrij medium. Over het algemeen kan incubatie met Rosup bij 37 ℃ gedurende 30 min-4 uur in het donker de ROS aanzienlijk verhogen.
[Opmerking]: De incubatietijd van Rosup is afhankelijk van de gevoeligheid van de cellijn. Bijvoorbeeld 30 min voor Hela en 1,5 uur voor MRC5. Als de toename van ROS niet binnen 30 minuten wordt waargenomen, kan de inductietijd of de concentratie op passende wijze worden verhoogd. Als ROS te snel stijgt, kan de inductietijd of de concentratie op passende wijze worden verlaagd.
Geneesmiddelen: Bereid het gewenste geneesmiddel in compleet medium met 10% FBS of een andere geschikte oplossing tot de gewenste concentratie.
2. Aanbevolen protocol voor aanhechtende cellen
a) Celbereiding: Kweek hechtende cellen in standaard celkweekmedia de dag vóór het experiment, zodat de celconfluentie 70% bedraagt ​​op het moment van het experiment.
b) Medicijninductie: verwijder de media. Bedek elke well met eerder bereide serumvrije verdunde medicijnen en incubeer gedurende de gewenste tijd bij 37°C in het donker.
c) (Optioneel) Positieve controle: Bedek de positieve controleput met de eerder bereide Rosup-oplossing en laat gedurende de gewenste tijd in het donker bij 37°C incuberen.
[Opmerking]: Voor cellen met een korte stimulatietijd (meestal binnen 2 uur) kan de sonde ook eerst worden geladen en kan vervolgens Rosup of een interessant medicijn worden toegevoegd.
d) ROS-sonde laden: Verwijder al het medium en was de cellen 1-2 keer met serumvrij medium. Bedek elke well met eerder bereide DCFH-DA-oplossing. Incubeer 30 min bij 37℃ in het donker.
e) Verwijder het medium en was de cellen 1-2 keer met serumvrij medium om vrij DCFH-DA te verwijderen.
3. Aanbevolen protocol voor suspensiecellen
a) Celbereiding: Kweek de suspensiecellen tot ongeveer 1,5 × 105 cellen per putje op de dag van het experiment.
b) Inductie van geneesmiddelen: verzamel cellen in een conische buis door middel van centrifugatie en resuspendeer ze in een geschikte hoeveelheid van eerder bereide serumvrije verdunde geneesmiddelen en incubeer ze gedurende de gewenste tijd bij 37°C in het donker.
c) (Optioneel) Positieve controle: Resuspendeer de positieve controlecellen met de eerder bereide Rosup-oplossing en incubeer gedurende de gewenste tijd bij 37°C in het donker.
d) ROS-sonde laden: Verzamel in een nieuw buisje en was de cellen door ze twee keer te centrifugeren in PBS. Resuspendeer de cellen met eerder bereide DCFH-DA-oplossing met een celdichtheid van 1×106-2×107/mL. Incubeer vervolgens 30 min. bij 37℃ in het donker. Keer het buisje elke 3-5 minuten om om volledig contact tussen de sonde en de cellen te garanderen.
[Opmerking]: De celdichtheid moet worden aangepast volgens de daaropvolgende detectiemethode. Bijvoorbeeld, voor flowcytometrie mag het aantal cellen in een enkele buis niet minder dan 104/mL of meer dan 106/mL zijn.
e) Verzamel en was de cellen door ze tweemaal te centrifugeren met serumvrij medium om vrij DCFH-DA te verwijderen.
4. Fluorescentiedetectie en gegevensanalyse
Fluorescentiemicroscopie Meting: Voer live celmicroscopie uit met een filterset die geschikt is voor fluoresceïne (FITC) met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Scoor cellen visueel op helderheid en vergelijk tussen controle en monsters of gebruik beeldanalysemethoden om signalen tussen digitale foto's van cellen te vergelijken.
Flowcytometriemeting: De aanhechtende cellen moeten worden verzameld met trypsine om een ​​enkele celsuspensie te bereiden; Voor suspensiecellen worden de cellen direct verzameld. Idealiter moeten 10.000 cellen per experimentele conditie worden geanalyseerd. Cellen mogen niet te dicht zijn tijdens het experiment (<1 ×106 cellen/ml). Sluit puin uit en isoleer de celpopulatie van interesse met gating. Bepaal met behulp van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit de vouwverandering tussen controle- en behandelde monsters met Ex/Em = 480/525 nm.
Fluorescentie microplaatmeting: Meet de plaat direct op een fluorescentieplaatlezer bij Ex/Em = 480/525 nm in eindpuntmodus in aanwezigheid van media. Trek blanco metingen af ​​van alle metingen en bepaal de vouwverandering van de assaycontrole.

Voorzorgsmaatregelen

1. Was de cellen na incubatie met DCFH-DA om achtergrondruis te verminderen.
2. Het wordt aanbevolen om de fluorescentie zo snel mogelijk na incubatie te meten om mogelijke fouten te voorkomen.
3. Voor uw eigen veiligheid en gezondheid verzoeken wij u om tijdens de operatie een labjas en wegwerphandschoenen te dragen.
4. Alleen voor onderzoeksdoeleinden!