Puromycine is een aminoglycoside antibioticum geproduceerd door fermentatie en metabolisme van Streptomyces alboniger, dat Gram-positieve bacteriën, verschillende dierlijke en insectencellen doodt door de eiwitsynthese te remmen. Puromycine is in sommige gevallen effectief tegen E. coli. Het mechanisme is dat puromycin is een analoog van de 3'-terminal van aminoyl-TrNA-moleculen, die zich kunnen binden aan de A-site van het ribosoom en kunnen worden opgenomen in de uitgebreide peptideketen. Nadat puromycine zich aan de A-site bindt, zal het niet deelnemen aan enige volgende reacties, wat resulteert in voortijdige beëindiging van de eiwitsynthese en vrijgave van onrijpe polypeptiden die puromycine bevatten aan de C-terminus.

Het pac-gen dat in de puromycine-producerende stam Streptomyces alboniger wordt aangetroffen, codeert voor een puromycine-N-acetyltransferase (PAC) die resistentie tegen puromycine verleent. Deze eigenschap wordt nu algemeen gebruikt om stabiel getransfecteerde cellijnen van zoogdieren te screenen die pac-genplasmiden dragen.

De algemene toepassing van puromycine bij de selectie van stabiele celtransfecties is gerelateerd aan de kenmerken van lentivirale vectoren. De meeste commerciële lentivirale vectoren dragen nu het pac-gen. In sommige specifieke gevallen kan puromycine ook worden gebruikt om te screenen op de transformatie van E. coli-stammen die het pac-genplasmide dragen.

Dit product is geschikt voor celkweek, de gebruikelijke werkconcentratie is 1-10 µg/ml.

In aanvulling, Yeasen Het bedrijf levert puromycine (cat.nr. 60209ES) ook in oplossingsvorm, die zich in een andere toestand bevindt, maar dezelfde functie heeft.

Functies

Zuiverheid≥98%

Toepassingen

Geschikt voor celkweek

Screen specifieke zoogdier stabiel getransfecteerde celstammen die plasmiden dragen die het pac-gen dragen

Scherm de getransformeerde E. coli-stammen die het pac-genplasmide dragen

Specificaties

Componenten

Verzending en opslag

De Puromycin Dihydrochloride Producten moeten worden bewaard bij -15℃ ~ -25℃ voor 2 jaren.

Instructies

1. Aanbevolen werkconcentratie

Zoogdiercellen: 1-10 μg/mL, de optimale concentratie moet worden bepaald door middel van de dodingscurve.

Escherichia coli: LB-agarmedium werd gebruikt om Escherichia coli te screenen die stabiel was getransformeerd met het pac-gen in een concentratie van 125 μgram/ml.

Opmerking: Voor het screenen van stabiele E. coli-stammen met puromycine is een nauwkeurige pH-aanpassing vereist.

Aanbevolen concentraties van puromycin waterstofchloride

2. Oplossingsmethode

Los puromycine op in gedestilleerd water om een ​​voorraadoplossing van 50 mg/ml te bereiden. Na sterilisatie door filtratie door een 0,22 μm filtermembraan, aliquot en bewaar bij -25 tot -15℃Als alternatief kan het worden opgelost in methanol om een ​​bewaaroplossing van 10 mg/ml te bereiden.

3. Bepaling van puromycin killing curve (met shRNA-transfectie of lentivirus-transductie als voorbeeld)

De effectieve screeningconcentratie van puromycin is gerelateerd aan celtype, groeistatus, celdichtheid, celmetabolisme en celcycluspositie. Om te screenen op stabiel tot expressie brengende shRNA-cellijnen, is het van cruciaal belang om de minimale concentratie puromycine te bepalen die niet-getransfecteerde/getransduceerde cellen doodt. Het wordt aanbevolen dat klanten die voor het eerst experimenten uitvoeren, een killcurve vaststellen die geschikt is voor hun eigen experimentele systeem.

1) Dag 1: De 24-wells plaat wordt geplateerd met een dichtheid van 5-8×104 cellen/well, en een voldoende aantal wells worden geplateerd voor daaropvolgende gradiëntexperimenten. Cellen werden 's nachts geïncubeerd bij 37℃.

2) Dag 2: A) Bereid het screeningsmedium voor: vers medium met verschillende concentraties puromycine (zoals 0-15 μg/ml, ten minste 5 gradiënten); B) Vervang het vers bereide screeningmedium in de cellen na een incubatie van een nacht; Vervolgens worden de cellen geïncubeerd bij 37℃.

3) Dag 4: Vervang het selectiemedium door vers medium en observeer de levensvatbaarheid van de cellen.

4) Afhankelijk van de groeifase van de cellen, ververst u het selectiemedium elke 2-3 dagen naar vers.

5) De cellen werden dagelijks gecontroleerd om het aantal levensvatbare cellen te observeren en zo de laagste concentratie van het geneesmiddel te bepalen die effectief was om niet-getransfecteerde of alle niet-getransduceerde cellen te doden binnen 4-6 dagen na het begin van de antibioticascreening.

4. Screening van stabiel getransfecteerde cellijnen van zoogdieren

Na transfectie van het plasmide dat het pac-gen bevatte, werden de cellen vermeerderd in een medium met puromycine om stabiele transfectanten te selecteren.

1) 48 uur na transfectie worden de cellen (oorspronkelijk of verdund) gekweekt in vers medium met een geschikte concentratie puromycine.

Let op: Antibiotica zijn het meest effectief wanneer cellen actief delen. Als de cellen te dicht zijn, zal de effectiviteit van antibiotica aanzienlijk worden verminderd. Het is het beste om cellen te platen met een dichtheid van niet meer dan 25%.

2) Verwijder en vervang het kweekmedium dat puromycin elke 2-3 dagen.

3) Celgevormde foci worden 7 dagen na screening beoordeeld. Laesies kunnen een extra week of langer nodig hebben, afhankelijk van de gastheercellijn en de efficiëntie van de transfectiescreening.

Let op: Observeer de celgroeistatus elke dag. Screening van puromycine vereist ten minste 48 uur en de screeningperiode van effectieve concentratie van puromycine is over het algemeen 3-10 dagen.

4) Breng 5-10 resistente klonen over en plaats ze in een 35 mm Petrischaal en blijf 7 dagen kweken met selectiemedium. Deze verrijkingscultuur is bedoeld om toekomstige cytotoxiciteitsexperimenten voor te bereiden.

Documenten:

Veiligheidsinformatieblad

60210_MSDS_HB220421_NL.pdf

Handleidingen

60210_Handleiding_HB250114_NL.pdf

Citaten en referenties:

[1] Furge KA. et al., 2001. Onderdrukking van Ras-gemedieerde tumorigeniciteit en metastasering door remming van de Met-receptortyrosinekinase. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014. Rab5 is nodig in gemetastaseerde kankercellen voor Caveolin-1-versterkte Rac1-activering, migratie en invasie. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Beloningsgebaseerde hypertensiecontrole door een synthetische hersenen-dopamine-interface. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotische BID is een ATM-effector in de DNA-schaderespons Cell. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) induceert een CCR5-afhankelijke versnelde afstoting van syndecan-1 (CD138) en syndecan-4 uit HeLa-cellen en -vormen.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. Het erfelijke hemochromatose-eiwit, HFE, remt de ijzeropname via downregulatie van Zip14 in HepG2-cellen [J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (31): 21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Het TSC1-TSC2-complex is vereist voor de juiste activering van mTOR2[J]. Molecular and Cellular Biology, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KDownregulatie van micro-RNA-1 (miR-1) bij longkanker. Onderdrukking van tumorigene eigenschappen van longkankercellen en hun sensibilisatie voor doxorubicine-geïnduceerde apoptose door miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, et al. Integratie van bacteriofaag Mu in gist- en zoogdiergenomen [J]. Nucleïnezurenonderzoek, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. Een niet-canoniek cGAS-STING-PERK-pad faciliteert het translationele programma dat cruciaal is voor veroudering en orgaanfibrose. Nat Cell Biol. 2022 mei;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 mei. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 in kleine extracellulaire vesikels afkomstig van HNSCC definieert tumor-geassocieerde immunosuppressie gemedieerd door macrofagen in de micro-omgeving. J Extracell Vesicles. 2022 mei;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al.Identificatie van ubiquitine-specifiek protease 32 als een oncogen in glioblastoom en de onderliggende mechanismen. Sci Rep. 2022 19 apr;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. Uterus globulin associated protein 1 (UGRP1) bindt podoplanine (PDPN) om een ​​nieuw ontstekingspad te bevorderen tijdens Streptococcus pneumoniae-infectie. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. MORTALIN-Ca2+-as drijft aangeboren rituximab-resistentie aan bij diffuus grootcellig B-cellymfoom. Cancer Lett. 2022 1 jul; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 18 apr. PMID: 35447282.