G418 Sulfate, ook bekend als Geneticin Sulfate, is een amino-glycoside antibioticum en structureel vergelijkbaar met Gentamycin B1. Het verstoort de eiwitsynthese door 80s ribosomen te binden en elongatiestappen te blokkeren. G418 Sulfate is giftig voor zowel prokaryotische als eukaryotische cellen, waaronder bacteriën, gist, hogere planten- en zoogdiercellen, evenals protozoa en wormen. Het resistentiegen (voornamelijk neo), dat zich bevindt in transposon Tn601 (903) of Tn5, is afkomstig van bacteriën, maar kan tot expressie worden gebracht in eukaryotische cellen. Het resistentiegen kan in cellen worden geïntroduceerd via gen-recombinatietechnieken om resistentie van G418 te verkrijgen, wat kan worden gebruikt om de kweek van prokaryotische of eukaryotische cellen met resistentiegen te screenen en te onderhouden.

In zoogdiercellen codeert neo, de expressie van amino-glycoside 3'-fosfotransferase (APH (3') II) na integratie in het eukaryotische genoom. Dit enzym inactiveert het antibioticum door covalente modificatie van de amino- of hydroxylfunctie van G418 en remming van de antibioticum-ribosoominteractie, waardoor de cel G418-resistentie krijgt. Bij screening van stabiele cellijnexperimenten moeten de dodingscurven (dosis-responscurven) worden vastgesteld om de minimale effectieve concentratie te bepalen voor het doden van niet-resistente cellen.

In plantencellen kan resistentie worden verkregen door transfectie van nptII-gen-resistente plasmide. Het nptII-gen codeert ook voor aminoglycosidefosfotransferase, een enzym dat verschillende antibiotica inactiveert, waaronder G418, kanamycine en palomycine.

Functies

Zuiverheid≥98%

Gestandaardiseerde productie, gebruikmakend van de fabrieksmatige massaproductiemodus

Breed scala aan toepassingen, die kunnen worden gebruikt op het gebied van moleculaire biologie en biochemisch experimenteel onderzoek van weefselkweek

Het samenwerkingsplatform bestrijkt het gehele

Om de stabiliteit van de productkwaliteit te garanderen, wordt het verschil tussen partijen binnen 1% gehouden

Toepassingen

Screening van stabiel getransfecteerde cellijnen

Specificaties

Componenten

Verzending en opslag

De G418 Sulfaat (Geneticine) Producten moeten worden bewaard bij -15℃ ~ -25℃ voor 3 jaren.

Instructies

1. Bereiding van G418-bewaaroplossing (50 mg/ml, actieve concentratie)

1) Omrekening van activiteitseenheden

De conversie werd uitgevoerd volgens deze formule: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Potentiewaarde van G418, die varieert van batch tot batch. Zie het batchkwaliteitsrapport of het etiket op de fles.

A1: De concentratie van actief G418 die u wenst.

A2: De werkelijke concentratie van G418.

Bijvoorbeeld, als de G418-activiteitswaarde van de batch 750 U/mg is en de actieve concentratie van G418 50 mg/ml is, is de werkelijke poederconcentratie die moet worden bereid 1000/750×50 mg/ml = 66,67 mg/ml. Als 10 ml G418-bewaaroplossing (actieve concentratie, 50 mg/ml) wordt bereid, moet 666,7 mg poeder worden afgewogen.

2) Sterilisatie en conservering

Weeg het poeder dat u met bovenstaande omrekening hebt verkregen en voeg 10 ml steriel gedemineraliseerd water toe tot het volledig is opgelost.

Bevochtig het 0,22 μm naaldfilter met 5 ml steriel gedemineraliseerd water en steriliseer vervolgens de G418-oplossing door middel van filtratie.Verdeel de gesteriliseerde G418-oplossing en bewaar bij -20℃.

Let op: ① Filter de troebele oplossing niet, omdat de oplossing dan nog niet volledig is opgelost. Het filtratieproces zal leiden tot verlies van het geneesmiddel en een afname van de activiteit van de uiteindelijke oplossing. ② Het wordt afgeraden om kweekmedia, fosfaatoplossingen of organische oplosmiddelen te gebruiken om de bewaaroplossing te bereiden.

2. Veelgebruikte screeningconcentratie

Over het algemeen is een hoge concentratie G418 in eerste instantie vereist voor het screenen van transforters en gebruik een lage concentratie om de cultuur te behouden. Groeiomstandigheden, celtypen en andere omgevingsfactoren kunnen de effectieve dosering van G418 beïnvloeden, dus het wordt aanbevolen om de optimale screeningconcentratie te bepalen via de killingcurve (dosis-responscurve).

Over het algemeen bedraagt ​​het screeningsbereik van zoogdiercellen 200-2000 μg/ml, plantencellen: 10-100 μg/ml, gistcellen: 500-1000 μg/ml.

Experimentele gegevens van cellijnen

3. Vaststelling van de dodencurve

Opmerking: Om te screenen op cellijnen met stabiele expressie van doelproteïnen, is het noodzakelijk om de minimale concentratie antibiotica te bepalen die ongetransfecteerde gastheercellen kan doden. Dit kan worden bereikt door een killingcurve (dosis-responscurve) op te stellen. Er moeten ten minste zes concentraties worden geselecteerd. G418 is het meest actief bij de behandeling van mitotische cellen, dus cellen moeten gedurende een bepaalde tijd worden gekweekt voordat G418 wordt toegevoegd.

1) Dag 1: Niet-getransformeerde cellen worden op een geschikte kweekplaat geplaatst met een celdichtheid van 20-25% bij 37℃ en een nacht gekweekt in CO₂;

Let op: Voor cellen waarbij een hogere dichtheid nodig is om de levensvatbaarheid te kunnen vaststellen, kan de hoeveelheid inoculatie worden verhoogd.

2) Stel de G418-concentratiegradiënt in binnen het juiste bereik volgens het celtype. Zoogdiercellen kunnen worden ingesteld op 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Dag 2: Verwijder het oude medium en vervang het door een vers bereid medium met de overeenkomstige concentratie van medicijnen. Maak drie parallelle voor elke concentratie.

4) Vervang het vervolgens elke 3-4 dagen door verse media met G418.

5) Levende celtellingen worden uitgevoerd in een vaste cyclus (bijv. elke 2 dagen) om de juiste concentratie te bepalen. Kies de minimale concentratie, die de meerderheid van de cellen binnen een ideaal aantal dagen doodt (meestal 7-10 dagen), als de werkconcentratie voor stabiele transfectiecelscreening.

4. Screening van stabiele getransfecteerde cellen

1) 48 uur na transfectie werd G418-kweekmedium met de juiste concentratie gebruikt voor de subcultuur (directe subcultuur of verdunde subcultuur).

Let op: Om goede screeningresultaten te verkrijgen, wordt aanbevolen de cellen niet meer dan 25% te verdunnen.

2) Vervang het screeningmedium met de medicijnen elke 3-4 dagen.

3) Meet de celkolonievorming na 7 dagen screening. Kolonievorming kan nog een week of langer duren, afhankelijk van het type gastheercel, transfectie en effectiviteit van de screening.

4) 5-10 resistente klonen werden geselecteerd en overgebracht naar 35 mm celkweekplaten en gedurende 7 dagen gekweekt met screeningmedium dat het geneesmiddel bevatte.

5) Vervang door normaal medium.

Documenten:

Veiligheidsinformatieblad

60220_MSDS_HB220421_NL.pdf

Handleidingen

60220_Handleiding_HB250115_NL.pdf

Cijfers

Figuur 1.Stabiliteitstest en validatie van effectieve concentratie genomycine tussen verschillende batches

Experimentele stam: E. coli

G69 en G99 zijn twee verschillende batches

De gebruiksconcentratie van genomycine werd bepaald op respectievelijk 8 mg/L, 12 mg/L en 16 mg/L, en de effectieve minimumconcentratie werd bepaald op 16 mg/L, wat de groei van diverse bacteriën perfect remde. De prestaties van de twee batches waren consistent.