Hygromycine B, een aminoglycoside antibioticum dat gesynthetiseerd wordt door Streptomyces hygroscopicus, remt de eiwitsynthese door de 70S ribosomale translocatie te verstoren en een verkeerde interpretatie van het mRNA-sjabloon te veroorzaken, waardoor prokaryoten (zoals bacteriën), eukaryoten (zoals gisten en schimmels) en hogere zoogdiereukaryoten worden gedood.

Hygromycine-resistentiegenen (hyg of hph) afkomstig van Escherichia coli coderen hygromycine B-fosfotransferase, dat hygromycine B ontgift tot een niet-biologisch actief gefosforyleerd product, waardoor het een uitstekende selectieve marker is voor het screenen en kweken van prokaryotische of eukaryotische cellen die succesvol zijn getransfecteerd met hytromycine-resistentiegenen. Bovendien wordt hygromycine B vanwege verschillende werkingswijzen vaak gebruikt in combinatie met G418 of Blasticidine S voor de selectie van dubbelresistente cellijnen. Hygromycine B kan ook worden gebruikt als antiviraal middel omdat het selectief doordringt in cellen met verhoogde membraanpermeabiliteit als gevolg van virale infectie en translatie remt. Het kan ook werken als insectenwerend middel via vermenging met diervoeder.

Dit product is een steriele hygromycine B-oplossing (50 mg/ml in PBS-buffer) en kan direct worden verdund voor gebruik met een kweekmedium.

Functies

Gestandaardiseerde productie, gebruikmakend van de fabrieksmatige massaproductiemodus

Toepassingen

Steriel

Screening van stabiel getransfecteerde cellijnen

Specificaties

Componenten

Verzending en opslag

De Hygromycine B (50 mg/ml) producten moeten worden bewaard bij 2℃ ~ 8℃ voor 2 jaren.

Instructies

1. Veelgebruikte screeningconcentratie

De werkconcentratie van hygromycine B die wordt gebruikt om stabiele overdrachtsstammen te screenen, moet variëren afhankelijk van het celtype, medium, groeiomstandigheden en de celstofwisselingssnelheid, met aanbevolen concentraties van 50-1000 μg/mL. Voor het eerste experimentele systeem wordt een killing curve (kill curve), de dosisreactiviteitscurve, aanbevolen om de optimale screeningconcentratie te bepalen.

In het algemeen, zoogdiercellen: 50-500 μg/ml; Bacteriële/plantencellen: 20-200 μg/ml; Schimmels: 300-1000 μgram/ml.

2. Vaststelling van de dodencurve

Opmerking: Om stabiele cellijnen te screenen, is het noodzakelijk om de minimale concentratie antibiotica te bepalen die in staat is om ongetransfecteerde gastheercellen te doden. Dit kan worden bereikt door een killingcurve (dosis-responscurve) op te stellen. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gerangschikt.

1) Dag 1: Niet-getransformeerde cellen worden in een geschikte kweekplaat geplaatst bij een celdichtheid van 20-25% en een nacht gekweekt.

Let op: Het aantal inoculatiecellen kan worden verhoogd voor cellen die een hogere dichtheid nodig hebben om vitaliteit te kunnen detecteren.

2) Stel de concentratiegradiënt in binnen het juiste bereik volgens het celtype. Zoogdiercellen kunnen 50, 100, 250, 500, 750, 1000 instellen μg/mL. Verdun de Hygromycin B-oplossing 1:10 met gedemineraliseerd water of PBS-buffer tot 5 mg/mL. En verdun de oplossing vervolgens tot de overeenkomstige werkconcentratie volgens de volgende tabel.

3) Dag 2: Vervang door een vers bereid medium met de overeenkomstige concentratie van het medicijn. Maak drie parallelle monsters voor elke concentratie.

4) Vervang het medium vervolgens elke 3-4 dagen door nieuw medium met de medicijnen.

5) Voer tellingen van levende cellen uit op vaste intervallen (zoals elke 2 dagen) om de juiste concentratie te bepalen die de groei van niet-getransfecteerde cellen remt. Selecteer de laagste concentratie die de overgrote meerderheid van de cellen binnen het ideale aantal dagen (meestal 7-10 dagen) kan doden als de werkconcentratie voor stabiele transfectantselectie.

3. Screening van stabiel getransfecteerde zoogdiercellijnen

1) 48 uur na transfectie werden de cellen gesubkweekt in een screeningmedium met hygromycine B in de juiste concentratie (direct of verdund).

Let op: Antibiotica werken het beste op actief delende cellen. Als de cellen te dicht zijn, zal het antibioticum de cellen niet doden. Splits de cellen zodanig dat de cellen niet meer dan 25% confluent zijn.

2) Vervang het zeefmedium elke 3-4 dagen.

3) Meet de celkolonievorming na 7 dagen screening. Kolonievorming kan nog een week of langer duren, afhankelijk van het type gastheercel, transfectie en effectiviteit van de screening.

4) Selecteer 5-10 resistente klonen en breng ze over naar 35 mm celkweekplaten. Ze worden gedurende 7 dagen gekweekt in een screeningmedium dat het geneesmiddel bevat.

5) Vervang het medium door vers medium zonder medicijnen voor de kweek.

Documenten:

Veiligheidsinformatieblad

60224_MSDS_HB220420_NL.pdf

Handleidingen

60224_Handleiding_HB250115_NL.pdf