Aureobasidin A, ook bekend als AbA, Basifungin, breomycine A, is een cyclisch esterpeptide antibioticum geïsoleerd uit de draadvormige schimmel Aureobasidium Pullulans nr. R106. Het heeft een sterk antischimmelvermogen en is een remmer van de inositol gefosforyleerde ceramide synthase AUR1. Het is giftig voor gist, zelfs bij lagere concentraties (0,1-0,5 μg/ml). Soorten schimmels die gevoelig zijn voor Aureobasidine A zijn onder meer Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans en A. niger. Soorten schimmels die gevoelig zijn voor Aureobasidine A zijn onder meer tandgist (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces millet (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) en Aspergillus niger (A. niger.). Het werkingsmechanisme is dat Aureobasidine A de activiteit van inositolfosforamidiet (inositolfosforylceramide, IPC) synthase remt, waarvan de schimmelgroei afhankelijk is, en de synthese van sphingolipiden verstoort, waardoor de stam verder wordt gedood. Er zijn meer genen bestudeerd die coderen voor IPC-synthasen, zoals het AUR 1-gen van Saccharomyces cerevisiae en het AURA-gen van A. sinensis, dat homologie heeft. Het dempen van deze coderende genen maakt de stammen resistent tegen Aureobasidin A, zoals het AUR 1-C-gen.

Aureobasidin A is zeer geschikt als een drug selection marker voor het screenen van positieve klonen. Aureobasidin A-resistentie is ook een ideale reporter in gist single-hybrid en two-hybrid studies. Dit product is een oplossing van Aureobasidin A opgelost in methanol met een concentratie van 1 mg/ml.

Functies

Zuiverheid≥97%

Gestandaardiseerde productie, gebruikmakend van de fabrieksmatige massaproductiemodus

Toepassingen

Gist-twee-hybride-onderzoeken

Gist-één-hybride-onderzoeken

Strikte gist-geneesmiddelselectiemarker

Aureobasidine A-resistentie is een ideale reporter voor gisthybridisatiestudies

Specificaties

Componenten

Verzending en opslag

De Aureobasidine A(AbA） producten moeten worden bewaard bij -15℃ ~ -25℃ voor 2 jaren.

Instructies

1. Werkconcentratie

Raadpleeg de relevante literatuur voor de specifieke concentratie en onderzoek en optimaliseer deze op basis van uw eigen experimentele omstandigheden (zoals het experimentele doel, het celtype, de cultuurkenmerken, enz.).

2. Celexperiment (in vitro experiment)

Aureobasidine A remt de groei van gistcellen door zowel ceramide-intoxicatie als onthouding van essentiële inositolfosforylceramiden^[1].

Drievoudige tandemherhalingen van elk CArG-boxmotief werden gesynthetiseerd. Alle DNA-fragmenten werden gekloond in de Y1H-vector pAbAi (Clontech, Mountain View, VS) met behulp van geschikte restrictieplaatsen. Vervolgens werd elk samengesteld pAbAi-construct gelineariseerd met BstbI en getransformeerd in de Saccharomyces cerevisiae Y1HGold-stam volgens de Yeast Transformation System 2 Manual (Clontech, Mountain View, VS). Klonen die het gewenste DNA-fragment droegen, werden gescreend op auto-activering op synthetisch uracil-dropoutmedium aangevuld met Aureobasidine A in de concentratie van 100–900 ng/ml, zoals aangegeven (Clontech, Mountain View, VS)^[2].

De open leeskaders (ORF's) van SlBES1-genen werden geamplificeerd en geligeerd in pGBKT7-GAL4BD-plasmide. De fusie GAL4BD-SlBES1-constructen werden verder getransformeerd in Y2H Gold-gistcellen. De SD/−Trp-mediumplaten werden gebruikt om de gisttransformanten te kweken.De alfa-galactosidase-activiteit van de transformanten werd geïdentificeerd door X-alfa-gal en de expressie van AUR1-C werd gescreend door Aureobasidin A^[3].

3. Minimale remmende concentraties van Aureobasidine voor verschillende gisten

4. Werkprocedures (voor gisttransformatiesysteem dat resistent is tegen AbA)

1) Voeg 0,5 ml gistcultuur die een nacht heeft geduurd toe aan 50 ml YPD-medium (samenstelling: 1 l vloeibaar medium bevat 10 g gistextract, 20 g polypepton, 20 g D-glucose; voor vast medium voegt u 2% extra agar toe).

2) Broeden op 30℃ gedurende ongeveer 6 uur, totdat de OD660 1-2 is. Bij gebruik van diploïden, meet de OD660 op 2-4.

3) Centrifugeer op 1.000×g gedurende 5 minuten.

4) Resuspendeer het pellet in 10 ml oplossing A (samenstelling: 100 mM lithiumacetaat, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) en centrifugeer vervolgens op 1.000×g gedurende 5 minuten.

5) IkSuspendeer het pellet in Oplossing A totdat de OD660 150 bedraagt.

6) Doe 100 µL van de celsuspensie in een buis en incubeer bij 30℃ gedurende 1 uur.

7) Voeg 5 µg van de vector (circulair of lineair DNA) en 150 µg drager-DNA (dat is verhit tot 100 °C) toe.℃ (10 minuten laten staan ​​en daarna snel laten afkoelen).

Let op: pAUR101 heeft lineair DNA nodig voor transformatie. Het gebruik van circulair DNA zal de transformatie-efficiëntie verminderen of zelfs mislukken. pAUR112 en pAUR123 hebben compleet plasmide-DNA nodig voor transformatie.

8) Voeg 850 µL Oplossing B toe (samenstelling: los 40 g Polyethyleenglycol 4000 op in 100 ml Oplossing A en meng goed, bereid vers voor gebruik) en meng voorzichtig.

9) Broeden op 30℃ gedurende 30 minuten, daarna op 42℃ gedurende 15 minuten.

10) Laat het 10 minuten op kamertemperatuur komen.

11) Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 5000 tpm en resuspendeer het pellet in 5 ml YPD-medium.

12) Broeden op 30℃ gedurende 6 uur tot een nacht.

13) Centrifugeer bij 5.000-10.000 tpm en resuspendeer het pellet in 1-10 ml 0,9% NaCl.

14) Plaats 100 µL van de celsuspensie op YPD-selectieve mediumplaten (die een bepaalde concentratie AbA bevatten, afhankelijk van het stamtype).Broeden op 30℃ gedurende 3-4 dagen totdat de transformatie voltooid is.

15) Selecteer positieve transformanten en/of bepaal de transformatie-efficiëntie (uitgedrukt als het aantal getransformeerde kolonies per microgram plasmide-DNA).

Documenten:

Veiligheidsinformatieblad

60231_MSDS_HB220420_NL.pdf

Handleidingen

60231_Handleiding_HB250116_NL.pdf

Cijfers

Figuur 1. Groeidiagram van gistplaat

Experimentele stam:GS115

Gebruikshoeveelheid: 0,05 μg/ml、0,1 μg/ml、0,5 μg/ml、1 μg/ml

Behandeling: 3-5 Dagis om 3 uur0℃

De bovenste rij is de Yeasen product, en de onderste rij is het merk T *.