Com o rápido desenvolvimento de protina eciência, a tecnologia de purificação de proteínas tem uma parte cada vez mais vital no campo da pesquisa biológica e da indústria de biotecnologia. Como uma técnica central, envolve a integração das informações de codificação da proteína alvo nas células hospedeiras por meio de métodos de engenharia genética, para que possam ser induzidas a produzir eficientemente as proteínas necessárias. Posteriormente, uma série de etapas sofisticadas de operação in vitro são realizadas para atingir a extração de alta pureza de proteínas. A purificação de proteínas permite que os cientistas isolem tipos únicos de proteínas, o que é crucial para estudos aprofundados sobre a estrutura e função das proteínas, desenvolvimento de novos medicamentos, diagnóstico de doenças e promoção da aplicação da biotecnologia. Essa tecnologia não apenas garante a precisão dos experimentos científicos, mas também impulsiona continuamente o desenvolvimento das ciências da vida.
Figura 1. Diagrama esquemático da cromatografia de afinidade[1]
No campo da engenharia de proteínas, as etiquetas de fusão servem como uma ferramenta poderosa, que pode facilitar vários propósitos experimentais ao se ligar às proteínas alvo. As funções das etiquetas de fusão comuns estão listadas na tabela abaixo para referência. No entanto, uma vez que essas etiquetas permanecem nas proteínas de fusão após cumprirem suas funções auxiliares iniciais, elas podem ter efeitos adversos em experimentos subsequentes, como interferir em experimentos imunológicos animais ou afetar a atividade biológica de proteínas. Portanto, é crucial remover essas etiquetas de fusão desnecessárias para garantir a função normal das proteínas e a precisão dos experimentos.
Tabela 1. Introdução às funções de marcadores de fusão comuns e métodos de clivagem enzimática
| Etiqueta de fusão | Tamanho (KDum) | Função | Métodos comuns de clivagem enzimática |
| Dele | 0,84 | Benéfico para purificação, capaz de purificar proteínas solúveis/de inclusão do corpo. | Protease TEV |
| Bandeira | 1.01 | A proteína de propósito fundida com Fatraso a tag pode ser reconhecida pelo anticorpo contra Fatraso, de modo que a proteína de fusão contendo Fatraso A tag pode ser detectada e identificada por Western Blot, ELISA e outros métodos. | Enteroquinase |
| Imposto sobre bens e serviços | 26 | Aumenta a solubilidade das proteínas, sendo capaz de purificar apenas proteínas solúveis e proteger proteínas tóxicas. | Trombina |
| PMB | 44,4 | Aumentar a solubilidade da proteína e proteger proteínas tóxicas. | Protease TEV |
| NusA | 55 | Aumentar a solubilidade da proteína e proteger proteínas tóxicas. | Trombina |
| Sumô | 11.2 | Aumentar a solubilidade das proteínas, promover a proteína a partir de proteólise hidrólise e melhorar a estabilidade das proteínas. | Protease SUMO |
Hoje, temos o prazer de apresentar a você um produto de última geração para a remoção eficiente e precisa de etiquetas de fusão - UCF.METM rTEV Protease. Com seu procedimento experimental simples e fácil de operar, esta enzima pode convenientemente clivar tags desnecessárias de proteínas de fusão, obtendo assim proteínas alvo de alta pureza.
UCF.EUTM Protease rTEV
TEV Protease é uma protease amplamente usada para a clivagem de marcadores de fusão de proteínas recombinantes, conhecida por sua alta especificidade de sítio. Ela reconhece estritamente a sequência de sete aminoácidos EXXYXQ↓(G/S) e realiza clivagem precisa entre glutamina e glicina ou serina. A sequência de sete aminoácidos mais comum é Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Essa especificidade garante a precisão e eficiência no procedimento de processamento de proteínas.
Figura 2. Diagrama esquemático do mecanismo de ação da protease TEV[2]
UCF.EUTM rTEV Protease é uma protease recombinante que foi geneticamente modificada e finamente purificada. Ela não apenas retém a atividade funcional completa da enzima TEV natural, mas também exibe excelente estabilidade e especificidade em uma faixa de temperatura mais ampla. O resíduo de gDNA hospedeiro de to produto dele é muito baixo, garantindo maior eficiência de corte de etiquetas de fusão de proteínas em aplicações práticas e reduzindo efetivamente o risco de introdução de resíduos de substâncias exógenas. UCF.EUTM A protease rTEV exibe atividade ótima sob as condições de pH 7,0 e 30°C. No entanto, ela mantém a atividade mesmo sob uma ampla faixa de condições com pH 6,0-8,5 e temperatura de 4-30°C, para atender aos diferentes requisitos de processamento de proteínas. Vale mencionar que UCF.METM A protease rTEV tem uma etiqueta 6×His em seu N-terminal, que pode ser removida eficientemente pela resina Ni-NTA, alcançando assim a purificação precisa da proteína alvo.
Exibição de desempenho
1. Alta eficiência de clivagem: a etiqueta de proteína é clivada de forma mais completa
Usando a proteína de fusão (3 μg) contendo o UCF.METM Sítio de clivagem da protease rTEV como substrato, UCF.METM rTEV Protease em 10, 5 e 3 U foi adicionado respectivamente, e a reação foi realizada a 30°C por 1 h. O efeito de clivagem foi detectado por eletroforese em gel de agarose. Os resultados mostraram que YaliviarUCF.ME deTM A protease rTEV pode clivar o substrato de forma eficiente quando a quantidade de entrada foi maior que 3 U, com uma eficiência de clivagem de >90%.
Figura 3. Verificação da atividade de clivagem de UCF.METM Protease rTEV
2. Baixo resíduo de gDNA do hospedeiro: reduz efetivamente o risco de introdução de resíduos de substâncias exógenas
Ao testar o host (E. coli) resíduos de gDNA em diferentes lotes de UCF.METM rTEV Protease, os resultados mostraram que o resíduo de gDNA hospedeiro de UCF.METM A protease rTEV estava muito abaixo de <1 cópia/U.
Figura 4. Os resultados do resíduo de gDNA do hospedeiro em UCF.METM Protease rTEV
3. Amplas condições de aplicação: Capaz de atender a diferentes requisitos de processamento de proteínas.
Ao verificar a atividade de clivagem do UCF.METM rTEV Protease sob diferentes condições, os resultados mostraram que UCF.METM A protease rTEV apresentou forte atividade sob condições de 4-30°C, o que pode atender aos diferentes requisitos de aplicação dos clientes.
| Tempo de reação (o) | Atividade de clivagem sob diferentes temperaturas (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Ealiviarprodutos de proteína de corte de tag de fusão recomendados pela 's
| Produto Nome | Produto Nãoumber | |
| VET Protease | UCF.EUTM Protease rTEV | 20427ES |
| Enteroquinase | Enteroquinase recombinante | 20395ES |
| Protease SUMO | Protease SUMO | 20410ES |
| Protease 3C | Protease 3C | 20409ES |
Referências：
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Cromatografia de afinidade[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Page R C. Ensaio de dessupressão de fluorescência para a atividade da protease TEV[J]. Bioquímica analítica, 2022, 659: 114954.