Kit de síntese de RNA de alto rendimento T7 otimiza o sistema de reação de transcrição. O kit pode sintetizar o RNA fita simples eficientemente usando a RNA polimerase T7, o DNA fita dupla linear com a sequência promotora T7 como molde e NTPs como substrato para controlar a sequência de DNA a jusante do promotor. Durante a transcrição, nucleotídeos modificados podem ser adicionados ao substrato para preparar biotina ou RNA marcado com corante.

1. Introdução do kit de síntese de RNA de alto rendimento T7
2. Princípios de em vitro transcrição
3. Vantagens do kit de síntese de RNA de alto rendimento Yeasen T7
4. Desempenho do produto
5. Como usar este kit
6. Perguntas frequentes
7. Informações sobre pedidos

1. Introdução do kit de síntese de RNA de alto rendimento T7

O T7 High Yield RNA Synthesis Kit pode sintetizar transcrições longas e curtas, e o RNA pode ser produzido 100-200 μg com 1 μg de entrada de molde de DNA. O RNA sintetizado pode ser usado para várias aplicações downstream, como pesquisa de estrutura e função de RNA, proteção de RNase, hibridização de sonda, interferência de RNA, microinjeção e em vitro tradução.

2. Princípios de em vitro transcrição

Figura 1. Em vitro processo de transcrição

3. Vantagens do kit de síntese de RNA de alto rendimento Yeasen T7

Rendimentos extremamente altos — até 200 µg em 2 horas
Versátil — adequado para transcrições de RNA de 20nt-10000nt
Usos múltiplos — gera RNA não marcado, marcado ou encapsulado

4. Desempenho do produto

Figura 2. Comparação de rendimentos do IVT

Nota: Todos os reagentes de reação são de Kit de síntese de RNA T7 (Yeasen#10623 ou empresa B*). Os rendimentos de reação IVT de Yeasen e da empresa B* são mostrados acima.

Figura 3. Qualidade dos produtos transcricionais para diferentes comprimentos

Figura 4. O nível de expressão do mRNA transcrito em células HEK-293

Nota: O mRNA é coberto com enzima de encapsulamento de vacínia (Yeasen#10614/10615)

5. Como usar este kit

5.1 Descongelamento de reagentes

Centrifugue brevemente a T7 RNA Polymerase Mix e coloque no gelo. Descongele o 10× Transcription Buffer e os ribonucleotídeos (ATP, CTP, GTP, UTP), misture e centrifugue até o fundo do tubo, coloque o 10× Transcription Buffer em temperatura ambiente e coloque quatro tipos de ribonucleotídeos no gelo.

5.2 Prepare o sistema de reação de transcrição de acordo com a tabela a seguir

Tabela 1.Método de preparação do sistema de reação de transcrição

Observação:
a) A reação é preparada em temperatura ambiente. Como o 10× Transcription Buffer contém espermidina, a concentração de espermidina muito alta em baixas temperaturas causará precipitação do molde de DNA.
b) Transcrição curta (<100 nt), modelo de 2 µg pode ser usado, tempo de transcrição aumentado para 4-8 hs.
c) Para transcrições longas (>1000 nt), os modelos de plasmídeo linearizados são recomendados para transcrição.
d) Realizar a reação na máquina de PCR com a tampa quente aberta para evitar que a solução de reação evapore por muito tempo.
e) O produto da reação pode ter um precipitado branco. Este é pirofosfato de magnésio formado por pirofosfato livre e íons de magnésio durante a reação, o que não afetará os experimentos subsequentes. Você pode adicionar EDTA para removê-lo. Se você estiver preocupado com a adição de EDTA afetando experimentos subsequentes, o sobrenadante também pode ser recuperado por centrifugação.
f) Os reagentes e recipientes devem estar isentos de contaminação por RNase.

5.3 Incubar a 37°C por 2 horas

Misture a solução de reação acima, centrifugue brevemente até o fundo do tubo e incube a 37°C por 2 hs. Se o comprimento do transcrito for menor que 100 nt, aumente o tempo de reação para 4-8 hs.

5.4 Tratamento com DNase I (opcional)

Após a conclusão da reação, adicione 2 μL de DNase I (sem RNase) a cada tubo e incubar a 37 °C por 15 minutos para remover o DNA molde.

6. Perguntas frequentes

6.1 O rendimento da reação IVT é baixo

A qualidade do template está intimamente relacionada ao rendimento. Se o rendimento do grupo experimental for significativamente menor do que o do grupo de controle positivo, as possíveis razões podem ser.
① Os modelos contêm componentes que inibem a reação IVT.
② Há algo errado com os modelos.

6.2 Sugestões

① Repurifique o modelo.
② Confirme a concentração e a integridade dos modelos.
③ Aumente o tempo de reação.
④ Aumente a entrada do modelo.
⑤Experimente outras RNA polimerases e promotores correspondentes.

6.3 O rendimento de transcrições curtas é baixo

Se as transcrições alvo forem menores que 100 nt, estenda o tempo de reação para 4-8 horas ou aumente a entrada de modelos para 2ug em um sistema de reação de 20 μL.

6.4 Existem transcrições mais longas inesperadas

Se o resultado da eletroforese em gel mostrar que há transcrições mais longas inesperadas, as possíveis razões podem ser:
① Os modelos de plasmídeo podem não ser totalmente linearizados.
②Os modelos têm extremidades coesas com saliências de 3'.
③As transcrições têm uma estrutura secundária que não é completamente desnaturada.

6.5 Sugestões

①Verifique se os modelos de plasmídeo estão totalmente linearizados. Se necessário, execute a linearização do plasmídeo novamente.
②Selecione enzimas de restrição adequadas para linearizar moldes de plasmídeo e evitar produzir extremidades coesas com saliências 3'. É praticável usar fragmento de Klenow ou T4 DNA polymerase para produzir uma extremidade romba, se necessário.
③Use gel desnaturado para detectar transcrições.

6.6 Existem transcrições mais curtas inesperadas

Se o resultado da eletroforese em gel mostrar que há transcrições mais curtas inesperadas, as possíveis razões podem ser:
①Há uma sequência análoga à sequência de terminação da RNA polimerase T7 nos modelos.
②O conteúdo GC dos modelos é alto.

6.7 Sugestões

①Diminua a temperatura da reação (como 30℃), mas observe que às vezes diminuir a temperatura da reação reduzirá os rendimentos.
②Experimente outras RNA polimerases para catalisar a reação IVT.
③Se o conteúdo de GC dos modelos for alto, defina a temperatura da reação IVT em 42℃ ou adicione SSB ao sistema de reação IVT para aumentar os rendimentos e o comprimento das transcrições.

6.8 Há manchas nas transcrições durante a eletroforese em gel

Se houver manchas nas transcrições durante a eletroforese em gel, as possíveis razões podem ser:
①Há contaminação por RNase durante a operação experimental.
②Os modelos de DNA são contaminados por RNases.

6.9 Sugestões

①Certifique-se de que todos os reagentes sejam formulados com H2O livre de RNase. Use pontas de pipeta e tubos Eppendorf livres de RNase e use luvas e máscaras de látex descartáveis ​​durante a operação experimental.
②Repurifique os modelos de DNA.

7. Informações sobre pedidos

Os seguintes são produtos representativos oferecidos pela Yeasen. Tamanhos adicionais estão disponíveis. Nossos produtos são altamente otimizados para trabalhar em conjunto, para ajudar a garantir desempenho e reprodutibilidade superiores.
Também podemos fornecer serviços personalizados. Se você estiver interessado em um produto que não está mostrado, entre em contato conosco e trabalharemos com você para atender às suas necessidades.

Tabela 2.Informações do produto

Sobre a leitura:

Reagentes de grau GMP para síntese in vitro de mRNA

Yeasen Biotechnology GMP Grade mRNA Síntese In Vitro Matérias-primas