Ревматоидный артрит (РА) — хроническое воспалительное заболевание суставов, характеризующееся стойким синовитом, системным воспалением и эрозией костей и хрящей, что в конечном итоге может привести к анкилозу и деформации суставов. Животные модели РА широко используются для изучения патогенеза и методов терапии. Были созданы различные животные модели для изучения этиологии РА, патогенеза, факторов влияния, а также для исследования новых терапевтических целей и оценки новых методов лечения.

Модели животных РА можно в целом разделить на две категории: индуцированные и трансгенные модели. Распространенные индуцированные модели включают коллаген-индуцированный артрит (CIA) и адъювант-индуцированный артрит (AA), в то время как трансгенные мышиные модели включают трансгенные модели человеческого TNF-α и т. д.

Адъювант Фрейнда, изобретенный Жюлем Фрейндом в 1940-х годах, представляет собой масляно-водную антигенную эмульсию, полученную путем смешивания водного раствора антигена с масляным агентом и добавления эмульгатора. Это наиболее часто используемый адъювант в экспериментах на животных.

Адъювант Фрейнда делится на полный адъювант Фрейнда (CFA), содержащий Mycobacterium tuberculosis, и неполный адъювант Фрейнда (IFA) без Mycobacterium tuberculosis. Они в основном используются для индукции моделей коллаген-индуцированного артрита (CIA) и адъювант-индуцированного артрита (AA) у мышей.

Рисунок 1. Ревматоидный артрит человека.

Рисунок 2. Ревматоидный артрит у мышей.

1 Коллаген-индуцированный артрит (КИА) (только для справки)

1.1 Модель мыши

Модель CIA является одной из наиболее широко используемых моделей РА у мышей. Иммунизация животных гетерологичным коллагеном типа II может вызвать аутоиммунный ответ против коллагена типа II в суставном хряще с клиническими проявлениями полиартикулярного периферического артрита.

Метод построения модели: Коллаген бычьего типа II (CII) растворяют в ледяной уксусной кислоте при 4°C в течение ночи. Затем убитые нагреванием Mycobacterium tuberculosis (BCG) помещают в жидкий парафин для приготовления полного адъюванта Фрейнда (CFA). Оба смешивают и эмульгируют для приготовления эмульсии коллагена типа II. Эта эмульсия вводится подкожно в основание хвоста мыши в объеме 0,1–0,2 мл для того, чтобы вызвать воспаление. На 21-й день после первой иммунизации внутрибрюшинно вводят бустерную инъекцию 0,1–0,2 мл эмульсии коллагена типа II. После первой иммунизации у мышей будут местные воспалительные реакции, которые заживают примерно в течение недели; после адъюванта у мышей будет развиваться отек суставов, начиная с 24-го дня, прогрессирующий от задних лап к передним лапам, а затем к хвосту.

1.2 Модель крысы

Метод построения модели: Коллаген бычьего типа II (CII) смешивают с неполным адъювантом Фрейнда (IFA) в равных объемах и эмульгируют. В первый день крысам вводят инъекции внутрикожно в несколько мест, а через неделю им вводят внутрибрюшинную инъекцию. Модель получают в течение 3-7 дней после второй иммунизации. Через семь дней после сенсибилизации голеностопные суставы будут слегка опухшими и красными, а симптомы ухудшатся через 3 недели, возможно образование язв на коже; через 5-6 недель патологические изменения еще больше ухудшаются, суставной хрящ и субхондральная кость разрушаются и разрушаются паннусом.

2 Адъювантно-индуцированный артрит (АА) (только для справки)

Модель АА является наиболее широко используемой моделью РА у крыс и бывает двух типов: неполный адъювант Фрейнда (IFA) и полный адъювант Фрейнда (CFA).

Метод построения модели: Крысам делают внутрикожную инъекцию, чтобы вызвать воспаление.Модель обычно показывает постоянные воспалительные симптомы в течение 10-20 дней после индукции, достигая пика примерно через 20 дней. Воспаление в основном в голеностопном суставе, которое может поражать подушечку стопы и всю стопу. Симптомы опухания суставов аналогичны симптомам у пациентов с клиническим РА, но могут наблюдаться явления иммунной дисфункции.

3 этапа моделирования коллаген-индуцированного артрита (КИА) (только для справки)

• Бычий коллаген II типа (CII) растворяют в растворе ледяной уксусной кислоты в концентрации 2 мг/мл и оставляют на ночь при температуре 4°C.
• Неполный адъювант Фрейнда дополнен убитыми нагреванием Mycobacterium tuberculosis до концентрации 2-5 мг/мл. Концентрация Mycobacterium tuberculosis в полном адъюванте Фрейнда 60718ES, предоставленном Yisheng Biology, составляет менее 10 мг/мл.
• Раствор уксусной кислоты бычьего коллагена II типа смешивают с полным адъювантом Фрейнда в равных объемах и эмульгируют.
• Каждой подопытной мыши делают 4–6 подкожных инъекций в область спины общим объемом 0,1–0,2 мл.
• Через три недели неполный адъювант Фрейнда смешивают с уксуснокислым раствором бычьего коллагена II типа в равных объемах и эмульгируют, после чего каждой мыши делают 3–5 подкожных инъекций в основание хвоста общим объемом 0,1–0,2 мл.

4 этапа моделирования адъювантно-индуцированного артрита (АА) (только для справки)

• Подготовьте соответствующие реагенты, учитывая особенности экспериментальных и контрольных групп.
• Наблюдение и регистрация: Как правило, более 80% мышей проявляют симптомы артрита через 7-12 дней после второй иммунизации. Клинические симптомы оцениваются на основе покраснения и активности сустава мыши, а наблюдения регистрируются до эксперимента и на 3-й, 5-й, 7-й и 12-й дни после эксперимента, при этом критерии оценки следующие:

Таблица 1 Критерии оценки

Сосновной	Ссимптом
0	Активность была нормальной, признаков эритемы и отека не наблюдалось.
1	Активность была нормальной, наблюдалось только покраснение кожи и отсутствие значительного отека.
2	Активность слегка нарушена, когти, подушечки лап или коленные суставы покраснели.
3	Активность снижена, пальцы и суставы лап слегка деформированы и опухли.
4	Движение заблокировано, пальцы ног и суставы сильно покраснели и опухли, скованы или деформированы.

• Измерение мыши: Используйте измеритель объема лапы мыши для измерения объема сустава задней конечности мыши до и после эксперимента. Измерьте объем примерно на 5 мм ниже коленного сустава задней ноги каждой мыши три раза, запишите среднее значение, объем пропорционален степени покраснения и отека сустава. Обнаружение проводится каждые три дня.
• Патологическое исследование: возьмите мышей из экспериментальной и контрольной групп, снимите кожу, зафиксируйте 4% формальдегидом более чем на 48 часов, декальцинируйте 5% азотной кислотой в течение 2 часов, погрузите в ксилол и залейте в парафин. Сделайте срезы толщиной 6 мм, окрасьте HE и наблюдайте с помощью обычного оптического микроскопа, чтобы установить стандарт оценки для патологической диагностики.

5 изображений экспериментальных случаев (выдержки из литературы)