Сахарный диабет (СД) — системное хроническое заболевание обмена веществ, характеризующееся хроническим повышением уровня глюкозы в крови, вызванным сочетанием нескольких патологических факторов, представляет собой глобальную эпидемию здравоохранения и связано с семейной генетикой, факторами окружающей среды, и аутоиммунитет. Несмотря на то, что СД известен на протяжении тысячелетий и достигнуты большие успехи в его диагностике и лечении, в настоящее время нет лекарства от этой болезни, а ее последствия для общественного здравоохранения только растут. Поэтому особенно важно создать соответствующую модель СД на животных и прояснить патогенез СД и его осложнений. Обычно используемыми моделями СД на животных являются хирургическая резекция поджелудочной железы, химически индуцированный диабет, модель спонтанного диабета на животных и трансгенные животные и т. д.
В настоящее время модель заболевания диабетом, вызванного Стрептозотоцин (СТЗ) широко используется, подходит для долгосрочного наблюдения. СТЗ — это соединение нитрозомочевины, которое, попав в организм, может специфически разрушать β-клетки поджелудочной железы посредством следующих механизмов:
(1) Инъекция высоких доз СТЗ может вызвать снижение концентрации внутриклеточного кофермента I (НАД) в β-клетках и, таким образом, ингибировать НАД-зависимый энергетический и белковый метаболизм, что приводит к гибели клеток;
(2) СТЗ увеличивает уровень оксида азота (NO) продукция, которая, как было показано, участвует в повреждении β-клеток;
(3) Введенный в низкой дозе, STZ может запустить аутоиммунный процесс, приводящий к разрушению β-клеток островков поджелудочной железы: мертвые β-клетки, из-за низкой дозы STZ, могут фагоцитироваться макрофагами как антигены для выработки фактора стимуляции Th1, делая лимфоциты типа Th1 доминирующими. Затем лимфоциты типа Th1 вырабатывают IL-2 и IFN-γ, вызывая инфильтрацию воспалительных клеток в островке и высвобождение IL-1 и TNF-α, IFN-γ, NO и H2О2 убивать клетки, в конечном итоге вызывая СД.
Йесен Биотех обеспечивает высокий уровень успеха СТЗ (Кат.№60256ES) для моделирования: высокая чистота ≥ 98% (ВЭЖХ).
1 Стандартная операционная процедура для построения модели диабета, вызванного СТЗ
1.1 Подготовка животных
Существует выраженный половой диморфизм, и самцы более восприимчивы к развитию диабета. Поскольку эстроген мешает действию СТЗ, самки животных менее чувствительны к диабетогенному действию СТЗ, чем самцы. Исследования показали, что у самок низкий уровень моделирования и более высокий уровень смертности, чем у самцов, особенно типа I.
Сахарный диабет I типа (СД1): Крысы (170-200 г) и мышей (17-22 g) рекомендуются. После недели адаптивного кормления голодайте животных в течение 12 часов, а затем сделайте внутрибрюшинную инъекцию СТЗ, которую можно легко выполнить и с высоким процентом успеха.
Сахарный диабет II типа (СД2): Крысы (возраст 4–5 недель, вес 90–100 г, например, SD или Wistar) и мыши (возраст 4–5 недель, вес 16–20 г, например, C57, ICR или Kunming) должны получать пищу с высоким содержанием жиров и сахара в течение 4–6 недель до введения СТЗ, а масса тела может индивидуально достигать около 240–280 г и 30–35 г. SD рекомендуется для крыс, а C57 — для мышей.
1.2 Кормление животных перед введением СТЗ
СД1: Обеспечьте всем мышам и крысам свободный доступ к стандартному корму для грызунов и воде в течение 1–2 недель адаптивного кормления до лечения СТЗ.
СД2: Употребление пищи с высоким содержанием жиров и сахара для формирования резистентности к инсулину перед лечением СТЗ.
1.3 Подготовка реагентов
① Диета с высоким содержанием жиров и сахара
Диета с высоким содержанием жиров и сахара готовится путем смешивания основного корма для крыс с сахарозой, рафинированным свиным жиром и порошком яичного желтка в следующем массовом соотношении: 10% свиного жира, 20% сахарозы, 10% порошка яичного желтка, 0,5% холата натрия и 59,5% основного корма.
② STZ-натрийцитратный буфер
Приготовление раствора A и раствора B: Взвесьте 2,1 г лимонной кислоты (молекулярная масса: 210,14) и растворите ее в 100 мл дважды дистиллированной воды, чтобы приготовить раствор A; взвесьте 2,94 г цитрата натрия (молекулярная масса: 294,10) и растворите его в 100 мл дважды дистиллированной воды, чтобы приготовить раствор B.
Приготовление буфера цитрата натрия: смешать растворы A и B в определенном соотношении (1:1,32 или 1:1), отрегулировать pH до 4,2-4,5 и стерилизовать фильтрованием с использованием мембранного фильтра 0,22 мкм. Это дает требуемый буфер цитрата натрия; рекомендуется приготовить и использовать его немедленно.
Взвесьте лиофилизированный порошок STZ, поместите его в сухую стерильную бутылку, оберните алюминиевой фольгой и положите на лед. Добавьте предварительно охлажденный буфер цитрата натрия (1% м/о) для растворения и профильтруйте стерилизовать с использованием мембранного фильтра 0,22 мкм.
【Примечание】① После того, как порошок STZ извлечен из холодильника, его следует хранить при комнатной температуре и вдали от света в течение примерно 10 минут, пока он полностью не разморозится. ② После взвешивания бутылку с образцом STZ необходимо накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света, так как STZ нестабилен. ③ Не растворяйте STZ за один раз, если вы не имеете навыков в инъекциях. Рекомендуется растворять STZ группами в соответствии с опытом работы. Готовьте раствор STZ для одной группы за один раз, например, 10 или 15 крыс/мышей на группу.
1.4 инъекция СТЗ
Вводите инъекцию внутрибрюшинно или через хвостовую вену в зависимости от веса животного натощак. По сравнению с внутрибрюшинной инъекцией, инъекция в хвостовую вену имеет более высокую эффективность использования препарата, но технически более сложна. Если техника инъекции не отточена, чередуйте две группы для инъекции, и инъекция должна быть завершена в течение 30 минут.
СД1: Для мышей рекомендуется однократная высокая доза 100–200 мг/кг и многократные низкие дозы 20–50 мг/кг в течение пяти последовательных дней; для крыс рекомендуется доза 40–70 мг/кг, вводимая в виде однократной инъекции.
СД2:После кормления мышам пищей с высоким содержанием сахара и жиров в течение 1–2 месяцев рекомендуется доза 70–120 мг/кг, вводимая однократно; для крыс рекомендуемая доза составляет 25–40 мг/кг, вводимая однократно.
【Примечание】Рекомендуется провести предварительный эксперимент, чтобы определить подходящую дозировку STZ, учитывая разный вес, переносимость препарата, время голодания, метод инъекции и процесс кормления подопытных животных. Не проводите эксперимент слепо, напрямую следуя дозировке в литературе.
1.5 После инъекции
После инъекции СТЗ дайте животным свободно пить и есть. Меняйте подстилку каждый день. Содержите клетку в чистоте и сухости. Избегайте попадания прямых солнечных лучей. Дезинфицируйте как можно чаще.
【Примечание】После инъекции СТЗ уровень глюкозы в крови животных будет показывать три фазы: транзиторная гипергликемия (1-2 ч), транзиторная гипогликемия (6-10 ч) и постоянная гипергликемия (>72 ч). Инсулин и глюкоза должны быть предоставлены надлежащим образом.
1.6 Средство моделирования животных
Для моделей, не соответствующих критериям, СТЗ можно вводить дополнительно после стабилизации состояния животного (внутрибрюшинно в дозе 10-20 мг/кг, выбирая подходящую дозу в зависимости от конкретной ситуации) или дождаться нормализации уровня глюкозы в крови и затем вводить в обычной дозе. Однако для достижения желаемого эффекта часто требуется перезапустить процесс моделирования после возвращения в нормальное состояние.
2 Оценка СД, вызванный СТЗ модели животных
① Общая характеристика: потеря массы тела, полидипсия, полифагия и полиурия.
② Уровень глюкозы в крови натощак (FGB), уровень инсулина в сыворотке крови (FINS), толерантность к глюкозе через рот (OGT), уровень инсулина в сыворотке крови натощак (FSI) и чувствительность к инсулину.
③ Биохимические показатели сыворотки: Т-Хо, ТГ, ЛПВП, ЛПНП, КР, АМК, АЛТ и т. д.
④ Патология поджелудочной железы: окраска гематоксилином и эозином.
3 Возможные причины неудачи модели DM, вызванной STZ
① Низкое качество СТЗ. Чистота СТЗ для моделирования должна быть не менее 98% (ВЭЖХ-детекция).
② Разложение STZ. STZ легко смачивается раствором, его следует хранить в сухом месте, чтобы избежать попадания влаги. Порошок не следует долго хранить при комнатной температуре, а растворенный STZ очень нестабилен, с периодом полураспада при нейтральном pH 15 мин, и его следует использовать на месте. Пожалуйста, растворите STZ с кислым значением pH, желательно в ледяной бане.
③ Раствор СТЗ вводили в кишечник или другие органы.
Если модель не соответствует стандарту DM, рекомендуется наблюдать еще 3 дня. Если все еще не соответствует, повторить процедуру инъекции.
4 Причины высокой смертности животных, вызванной СТЗ
① Животные имеют недостаточный вес.
② Недостаточное снабжение питьевой водой.
③ Гипергликемия или гипогликемия, обычно гипергликемия. Это можно облегчить инъекцией инсулина или временным добавлением глюкозы.
Метод введения инсулиновой добавки: например, если Новолин Н или НПХ (нейтральный протамин цинк-инсулин) вводить по 2-3 единицы каждый раз, общая смертность крыс снизится через 3-5 дней.
Метод добавления глюкозы: Внутрибрюшинная инъекция 20% глюкозы через 4 часа после инъекции СТЗ может предотвратить гибель крыс из-за низкого уровня глюкозы в крови, вызванного голоданием.
④ Подопытные животные убивают друг друга из-за нехватки пищи и воды.
⑤ Инфекция. Животные с СД более других подвержены инфекциям, особенно инфекциям мочевыводящих путей и брюшной полости из-за полиурии. Необходимо проводить дезинфекцию до и после инвазивных операций, таких как внутрибрюшинная инъекция, подкожная инъекция и забор крови. Например, тетрациклин (или глазная мазь с ауреомицином) можно наносить на рану после каждого измерения уровня глюкозы в крови, чтобы предотвратить инфекцию.
5 факторов, влияющих на моделирование диабета
Факторы, влияющие на модель заболевания диабетом, включают качество реагента для моделирования STZ, состояние животных и способ введения. Основные эксплуатационные характеристики реагента включают чистоту, стабильность и растворимость. Состояние животных в основном включает генетический фон, пол, гендер, вес, среду размножения и структуру рациона. Способы введения включают время введения, интервалы между дозами и пути введения. Дифференцированные факторы вызывают дифференцированные эффекты моделирования.
6 Продукт грекомендация
| Название продукта | Кот# | Спецификация |
| 60256ES60 | 100 мг | |
| 60256ES76 | 500 мг | |
| 60256ES80 | 1 г | |
| Лимонная кислота, Моногидрат | 60347ES25 | 25 г |
| Тринатриевая соль лимонной кислоты, Дигидрат | 60348ES25 | 25 г |
| Растворитель для стрептозоцина СТЗ | 60750ES76 | 500 мл |
[1] Си З и др. Двойная модификация наночастиц позволяет преодолеть последовательные барьеры абсорбции при пероральной доставке инсулина. J Control Release. 2022 февраль;342:1-13. (PMID: 34864116, ЕСЛИ:7.727)