Что такое Ауреобазидин А?
Ауреобазидин А (AbA) — циклический пептидный антибиотик, выделенный из нитчатого гриба Aureobasidium pullulans No. R106, обладающий сильными противогрибковыми свойствами и способный быть токсичным для дрожжей при низких концентрациях (0,1–0,5 мкг/мл). Механизм действия AbA заключается в ингибировании активности инозитолфосфорилцерамидсинтазы (IPC-синтазы), фермента, кодируемого геном AUR1 у дрожжей, блокирующего синтез из церамида в инозитолфосфолипиды, что приводит к дефициту сфинголипидов, разрыву клеточной мембраны и, таким образом, гибели штамма. Виды грибов, чувствительные к AbA, включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans и A. niger.
Рисунок 1. Структурная формула AbA, CAS#127785-64-2
Исследования показали, что ген AUR1 Saccharomyces cerevisiae и ген AURA Aspergillus nidulans гомологичны, оба кодируют IPC-синтазу. Следовательно, мутации в этих двух генах могут придавать сильную устойчивость AbA штаммам, таким как мутировавший ген AUR1-C. AbA очень подходит в качестве маркера отбора лекарств для скрининга положительных клонов, и он не требует оптимизации условий с очень низким фоном. Устойчивость AbA также является идеальным репортером для исследований одиночных/двойных гибридов дрожжей и совместима с гибридными системами дрожжей, несущими соответствующую устойчивость.
Что такое дрожжевая одинарная/двойная гибридная система?
Дрожжевая двухгибридная система (Yeast two-hybrid assay) была создана Филдсом и Сонгом и другими на основе характеристик эукариотической транскрипционной регуляции. Она может быстро и напрямую анализировать взаимодействия между известными белками и широко используется при изучении взаимодействий антиген-антитело, открытии новых белков и новых функций белков, скрининге лекарственных мишеней и установлении геномных карт сцепления белков. Принцип дрожжевой двухгибридной системы заключается в том, что транскрипционный активатор эукариот содержит два различных структурных домена: домен связывания ДНК (ДНК-связывающий домен, DNA-BD) и домен активации транскрипции ДНК (Активационный домен, AD), которые могут быть независимо разделены, не влияя на функции друг друга. BD и AD по отдельности не могут активировать транскрипционный ответ, только когда они достаточно пространственно близки, они проявляют активность полного транскрипционного активатора, позволяя транскрибировать нижестоящий ген. При конструировании плазмид слияния двух исследуемых белков (белка X и белка Y) с доменами BD и AD соответственно и экспрессии их в одной и той же клетке дрожжей, если между двумя белками нет взаимодействия, ген-репортер не будет транскрибироваться; если два белка взаимодействуют, домены BD и AD будут пространственно близки, таким образом, ген-репортер будет транскрибироваться.
Рисунок 2. Принципиальная схема двугибридной дрожжевой культуры. [1]
Технология дрожжевых одногибридных технологий представляет собой инструмент для изучения взаимодействий нуклеиновых кислот и белков, разработанный на основе дрожжевых двухгибридных технологий, и широко используется для изучения регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках, например, для определения наличия взаимодействия между известной ДНК и известными белками; выделения новых белков, которые связываются с целевым цис-регуляторным элементом или другими короткими сайтами связывания ДНК; точного определения сайтов связывания ДНК, которые, как было доказано, взаимодействуют, и анализа доменов связывания ДНК белков. Ее основной принцип заключается в построении известного цис-действующего элемента выше самого основного промотора (минимального промотора, Pmin) и присоединении репортерного гена ниже Pmin. кДНК, кодирующая тестируемый фактор транскрипции, сливается с вектором экспрессии домена AD дрожжей и вводится в клетки дрожжей.Если продукт этого гена может связываться с цис-действующим элементом, он может активировать промотор Pmin, позволяя экспрессировать репортерный ген.
Рисунок 3. Принципиальная схема одногибридных дрожжей. [2]
Для исследований дрожжевых одиночных/двойных гибридов компания Yeasen предлагает продукцию 60231ES Ауреобазидин А (AbA), раствор AbA, растворенный в метаноле с чистотой ≥ 97% и концентрацией 1 мг/мл. Йесен рекомендует ингибирующую концентрацию AbA 100-1000 нг/мл в экспериментах с дрожжевыми одинарными/двойными гибридами, а конкретная рабочая концентрация зависит от чувствительности клеток-хозяев (см. следующую таблицу, Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) AbA для различных штаммов дрожжей).
| Бактёрский штамм | МИК (нг/мл) | |
| S.cerevisiae | ATCC9763 (диплоидный) | 200-400 |
| SH3328 (гаплоидный) | 100 | |
| дрожжи для сакэ (диплоидный) | 100-200 | |
| дрожжи для шочу (диплоидный) | 100 | |
| Пивные дрожжи (триплоид или тетраплоид) | 100 | |
| Пекарские дрожжи (диплоидный) | 200-400 | |
| Шизо.помбе | JY-745 (моноплоид) | 100 |
| C.albicans | ТИММ-0136 (диплоидный) | 40 |
| C.tropicalis | ТИММ-0324 (диплоидный) | 80 |
Применение кейса
Для изучения сайта связывания белка GmWRKY31 на промоторе гена GmSAGT1 в одногибридном эксперименте с дрожжами целевая последовательность ДНК была вставлена в вектор pBait-AbAi, содержащий ген-репортер урацила Ura3, расположенный выше гена AUR1-C. После трансформации дрожжей соответствующей плазмидой ее суспендировали в 0,9% растворе NaCl, а OD600 доводили до 0,005. Затем 100 мкл образца распределяли по чашкам, содержащим 500 нг/мл AbA, инвертировали и культивировали при 30℃ в течение 3–5 дней.[3].
Рисунок 3 Взаимодействие белка GmWRKY31 со штаммами дрожжей, содержащими фрагменты F16, F20, F73, delF16, delF20 или delF73.
Опубликованные статьи с нашими реагентами
[1] Шунан Чжан, Юйи Чжан, Каннинг Ли и др. Азот опосредует время цветения и эффективность использования азота с помощью регуляторов роста растений риса, Current Biology, том 31, выпуск 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (ЕСЛИ:10.834)
[2] Цзяин Куан, Инчунь Сюй, Идан Лю и др. NnSnRK1-центрированная регуляторная сеть раннего прекращения цветения лотоса под действием тени, Экологическая и экспериментальная ботаника, том 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (ЕСЛИ:5.7)
Сопутствующие товары
| Название продукта | Кот# | Спецификация |
| Ципрофлоксацина гидрохлорид | 60201ES05/25/60 | 5/25/100г |
| Ампициллин, натриевая соль | 60203ES10/60 | 10/100г |
| Доксициклин гиклат | 60204ES03/08/25 | 1/5/25г |
| Хлорамфеникол, класс USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100г |
| Канамицина сульфат | 60206ES10/60 | 10/100г |
| Тетрациклин HCl Тетрациклина гидрохлорид (USP) | 60212ES25/60 | 25/100г |
| Ванкомицина гидрохлорид | 60213ES60/80/90 | 100мг/1г/5г |
| Гентамицина сульфатная соль | 60214ES03/08/25 | 1/5/25г |
| Спектиномицина гидрохлорид | 60215ES08 | 5г |
| Флеомицин (20 мг/мл в растворе) | 60217ES20/60 | 20/5×20мг |
| Бластицидин S (Бластицидин) | 60218ES10/60 | 10/10×10мг |
| Нистатин | 60219ES08 | 5г |
| G418 Сульфат (Генетицин) | 60220ES03/08 | 1/5г |
| Пуромицин (Раствор 10 мг/мл) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 мл |
| Пуромицин дигидрохлорид | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 мг/1 г |
| Гигромицин В (50 мг/мл) | 60224ES03 | 1 г (20 мл)/10×1 г (20 мл) |
| Гигромицин В | 60225ES03/10 | 1/10г |
| Эритромицин | 60228ES08/25 | 5/25г |
| Тиментин | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2г |
| Ауреобазидин А (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1мг |
| Полимиксин В сульфат | 60242ES03/10 | 1/10МЕ |
Справочная документация
[1] Пайано А. и др. Двугибридный анализ дрожжей для идентификации взаимодействующих белков. Curr Protoc Protein Sci. 2019 февраль;95(1):e70.
[2] Джон С. и др. Дрожжевые одногибридные анализы: историческая и техническая перспектива. Методы. 2012 август;57(4): 441-447.
[3] Донг Х и др. Транскриптомный анализ транскриптов WRKY сои в ответ на инфекцию Peronospora manshurica. Геномика. 2019 декабрь;111(6):1412-1422.