1 Апринцип действия

Гигромицин В — аминогликозидный антибиотик, вырабатываемый в результате метаболизма Streptomyces hygroscopicus, который подавляет синтез белка, нарушая транслокацию и способствуя неправильному считыванию 80S рибосом, тем самым убивая прокариотические и эукариотические клетки.

В настоящее время он широко используется для скрининга и сохранения прокариотических или эукариотических клеток, содержащих ген устойчивости к гигромицину.

2 Применение

2.1Скрининг и поддержание культуры прокариотических или эукариотических клеток (клеток растений и клеток млекопитающих), стабильно трансфицированных Hph+векторы

Гигромицин Б Ген устойчивости (hyg или hph), полученный из Escherichia coli, кодирует фосфотрансферазу гигромицина B, которая превращает гигромицин B в биологически неактивный фосфорилированный продукт, тем самым осуществляя детоксикацию. Ввиду этого принципа гигромицин B является очень полезным селективным маркером для скрининга и поддержания культивируемых прокариотических или эукариотических клеток, успешно трансфицированных геном устойчивости к гигромицину.

2.2Из-за разницы в механизме действия гигромицин В часто используют в сочетании с генетицином G418, блеомицином и бластицидином s для скрининга линий клеток, стабильно трансфицированных двумя различными векторами.

Гигромицин В имеет другой механизм действия, чем G418 (кат. № 60220ES), Блеомицин (кат. № 60257ES) и бластицидины (кат. № 60218ES), поэтому он хорошо подходит для использования в сочетании с другими селективными антибиотиками в экспериментах с двойным отбором.

2.3 Противовирусное средство
2.4 В качестве антигельминтного средства его добавляют в корм для животных и выращивают животных.
2.5 Скрининг стабильно трансфицированных клеток

Рабочая концентрация гигромицина B, используемая для скрининга стабильных трансфектантов, варьируется в зависимости от типа клеток, среды, условий роста и скорости метаболизма клеток. Рекомендуемая концентрация составляет 50–1000 мкг/мл. Для первого использования экспериментальной системы рекомендуется определить оптимальную концентрацию скрининга путем построения кривой гибели, т. е. кривой зависимости реакции от дозы. В общем случае 50–500 мкг/мл для клеток млекопитающих; 20–200 мкг/мл для клеток бактерий/растений; 200–1000 мкг/мл для грибов.

3 Протокол

3.1 Приготовление раствора для хранения (50 мг/мл)

Взвесьте 0,5 г гигромицина B и добавьте 10 мл 1×PBS, pH 7,4. После полного растворения отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм для стерилизации. Аликвотируйте стерилизованный раствор и храните при -20℃.

3.2 Обычно используемая концентрация скрининга

Рабочая концентрация гигромицина B для скрининга стабильных штаммов варьируется в зависимости от типа клеток, питательной среды, условий роста и скорости метаболизма клеток. Рекомендуется установить кривую гибели (кривую зависимости реакции от дозы), чтобы впервые определить оптимальную концентрацию скрининга. Обычно клетки млекопитающих: 50–500 мкг/мл; клетки бактерий/растений: 20–200 мкг/мл; грибы: 300–1000 мкг/мл.

3.3 Установление кривой смертности

【Примечание】Для скрининга стабильных клеточных линий необходимо определить минимальную концентрацию антибиотиков, способных убить нетрансфицированные клетки-хозяева. Этого можно достичь, построив кривую гибели (кривую зависимости реакции от дозы). Необходимо организовать не менее пяти концентраций.

1) День 1: Нетрансформированные клетки высаживают в соответствующую культуральную чашку с плотностью клеток 20–25 % и культивируют в течение ночи.【Примечание】Количество инокуляционных клеток может быть увеличено для клеток, требующих более высокой плотности для определения жизнеспособности.

2) Установите градиент концентрации в соответствующем диапазоне в соответствии с типом клетки. Клетка млекопитающего может установить 50, 100, 250, 500, 750, 1000 мкг/мл. Разбавьте раствор гигромицина В 1:10 деионизированной водой или буфером PBS до 5 мг/мл. Затем разбавьте раствор до соответствующей рабочей концентрации согласно следующей таблице.

Конечная концентрация (мкг/мл)	Средний объем (мл)	Объем добавления 5 мг/мл гигромицина В (мл)
50	9.9	0.1
100	9.8	0.2
250	9.5	0,5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0

3) День 2: Заменить свежеприготовленной средой, содержащей соответствующую концентрацию препарата. Приготовить три параллельных образца для каждой концентрации.

4) Заменяйте среду свежей, содержащей лекарственные препараты, каждые 3–4 дня.

5) Подсчет живых клеток выполняется в фиксированном цикле (например, каждые 2 дня) для определения соответствующей концентрации для предотвращения роста нетрансфицированных клеток. Выберите минимальную концентрацию, которая убивает большинство клеток в течение идеального количества дней (обычно 7-10 дней), в качестве рабочей концентрации для скрининга стабильной клеточной линии.

3.4 Скрининг стабильно трансфицированных клеток

1) Через 48 ч после трансфекции клетки были пересеяны в среду для скрининга, содержащую гигромицин B в соответствующей концентрации (прямой или разбавленный). 【Примечание】Антибиотики лучше всего действуют на активно делящиеся клетки. Если клетки слишком плотные, антибиотик не убьет их. Разделите клетки так, чтобы они были не более чем на 25% слитыми.

2) Меняйте среду скрининга каждые 3–4 дня.

3) Измерьте образование колоний клеток через 7 дней скрининга. Образование колоний может занять еще неделю или больше, в зависимости от типа клетки-хозяина, трансфекции и эффективности скрининга.

4) Отберите 5–10 устойчивых клонов и перенесите их на 35-миллиметровые планшеты для культивирования клеток, а затем культивируйте в содержащей лекарственные средства скрининговой среде в течение 7 дней.

5) Заменить среду для культивирования на свежую без лекарственных препаратов.

4 объекта недвижимости

Гигромицин В — порошок от белого до желтовато-коричневого цвета со специфическим запахом, легко растворимый в воде, метаноле, этаноле и т. д., легко образует соли со многими органическими и неорганическими кислотами.

5 Хранение продукции

Раствор можно хранить при температуре 2~8℃ в течение более 6 месяцев.

6 Осторожно

1) Клетки, трансфицированные геном hph, устойчивы к гигромицину, и трансфицированные клетки экспрессируют ген стабильно или временно.

2) Ген устойчивости к гигромицину B (hyg или hph) был обнаружен и у других штаммов, включая Streptomyces hygroscopicus и Klebsiella pneumoniae, а также у E. Coli.

7 Рекомендации по продукту

Йесен обеспечивает Гигромицин В выпускается в двух формах: порошок (1 г/10 г, кат. № 60225ES) и раствор (50 мг/мл, кат. № 60224ES).

Название продукта	Кот#	Спецификация
Гигромицин В (50 мг/мл)	60224ES03	1 г (20 мл)
	60224ES10	10×1 г (20 мл)
Гигромицин В	60225ES03	1 г
	60225ES10	10г

8 Опубликованных статей с нашими реагентами

[1] Чжао Цюй, Чжэн К., Ма С. и др. PTPS облегчает компартментализированное S-нитрозилирование LTBP1 и стимулирует рост опухоли в условиях гипоксии. Мол Клетка . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (IF:14.548)

[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX и др. Динамическое профилирование состояния хроматина выявляет регуляторную роль ауксина и цитокинина в регенерации побегов. Ячейка разработки . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/j.devcel.2021.12.019 (IF:12.270)
[3] Чжан Т. Ц., Чэнь И., Ван Дж. В. Анализ отдельных клеток верхушки вегетативного побега Arabidopsis. Ячейка разработки . 2021;56(7):1056-1074. е8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (IF:12.270)
[4] Ван Ф. К., Шан Г. Д., У ЛИ, Сюй Ц. Г., Чжао Х. Ю., Ван Дж. В. Динамика доступности хроматина и иерархическая структура сети регуляции транскрипции для соматического эмбриогенеза растений. Ячейка разработки . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (ИФ:10.092)

[5] Чжу ГД, Ю Дж, Сан ЗЙ и др. Скрининг CRISPR/Cas9 по всему геному выявляет CARHSP1, ответственный за устойчивость к радиации в глиобластоме. Клеточная смерть Dis . 2021;12(8):724. Опубликовано 21 июля 2021 г. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (IF:8.469)
[6] Чен Дж., Хуан И., Тан З. и др. Скрининг транскрипционной активации CRISPR-Cas9 в масштабе генома в гене резистентности к метформину, связанном с раком предстательной железы. Передняя клетка Dev Biol . 2021;8:616332. Опубликовано 26 января 2021 г. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (IF:6.684)
[7] Цзян Ц, Цуй Ц, Чжу Ц и др. Разработка транспортеров Yarrowia lipolytica для высокоэффективного производства биологической янтарной кислоты из глюкозы. Биотехнологии Биотопливо . 2021;14(1):145. Опубликовано 27 июня 2021 г. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (IF:6.040)
[8] Лю И., Цзян Х., Цуй З., Ван З., Ци Ц., Хоу Дж. Инженерия маслянистых дрожжей Yarrowia lipolytica для производства α-фарнезена. Биотехнологии Биотопливо . 2019;12:296. Опубликовано 23 декабря 2019 г. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (IF:5.452)
[9] Чжоу Ч., Цзэн З., Суо Дж. и др. Манипулирование одним фактором транскрипции Ant1 способствует накоплению антоцианов в зернах ячменя. J Агропродовольственная химия . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (IF:5.279)

[10] Цуй З, Чжэн Х, Цзян Цз и др.Идентификация и характеристика точки начала репликации митохондрий для стабильной и эписомальной экспрессии в Yarrowia lipolytica. ACS Синтез Биол . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (IF:5.110)

9 Сопутствующие товары

Название продукта	Кот#	Спецификация
Ципрофлоксацина гидрохлорид	60201ES05/25/60	5/25/100г
Ампициллин, натриевая соль	60203ES10/60	10/100г
Доксициклин гиклат	60204ES03/08/25	1/5/25г
Хлорамфеникол, класс USP	60205ES08/25/60	5/25/100г
Канамицина сульфат	60206ES10/60	10/100г
Тетрациклин HCl Тетрациклина гидрохлорид (USP)	60212ES25/60	25/100г
Ванкомицина гидрохлорид	60213ES60/80/90	100мг/1г/5г
Гентамицина сульфатная соль	60214ES03/08/25	1/5/25г
Спектиномицина гидрохлорид	60215ES08	5г
Флеомицин (20 мг/мл в растворе)	60217ES20/60	20/5×20мг
Бластицидин S (Бластицидин)	60218ES10/60	10/10×10мг
Нистатин	60219ES08	5г
G418 Сульфат (Генетицин)	60220ES03/08	1/5г
Пуромицин (Раствор 10 мг/мл)	60209ES10/50/60/76	1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 мл
Пуромицин дигидрохлорид	60210ES25/60/72/76/80	25/100/250/500 мг/1 г
Гигромицин В (50 мг/мл)	60224ES03	1 г (20 мл)/10×1 г (20 мл)
Гигромицин В	60225ES03/10	1/10г
Эритромицин	60228ES08/25	5/25г
Тиментин	60230ES07/32	3.2/10×3.2г
Ауреобазидин А (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1мг
Полимиксин В сульфат	60242ES03/10	1/10МЕ