Апоптозом обычно называют вид запрограммированной клеточной смерти, которая происходит посредством регуляции внутриклеточных генов и их продуктов во время развития клеток или под действием некоторых факторов. Апоптоз играет важную роль в эмбриональном развитии и морфогенезе, стабильности нормальных популяций клеток в тканях, защите организма и иммунном ответе, повреждении и старении клеток, вызванных болезнями или отравлениями, а также возникновении и прогрессировании опухолей и имеет потенциальное терапевтическое значение.

События в апоптотическом пути происходят во временной последовательности, то есть события происходят последовательно и в конечном итоге приводят к появлению апоптотических тел с возникновением апоптоза.

Его типичные характеристики следующие:

1. Ранний апоптоз: изменения структуры клеточной мембраны, выворачивание фосфатидилсерина;

2. Ранняя и средняя стадия апоптоза: плотность цитоплазмы увеличивается, мембранный потенциал митохондрий исчезает, проницаемость изменяется, цитохром С высвобождается в цитоплазму;

3. Поздний апоптоз: передача сигнала апоптоза;

4. Поздний апоптоз: ДНК деградирует до фрагментов размером 180~200 п.н.

Рисунок 1: Возникновение и обнаружение последовательных событий в пути апоптоза.

1. Ранний апоптоз: Аннексин-V/PI двойное окрашивание (обнаружение ФС на внеклеточной мембране)

В нормальных живых клетках фосфатидилсерин (PS) находится на внутренней стороне клеточной мембраны. Когда происходит апоптоз, клеточная мембрана изменяется, и PS переворачивается с внутренней поверхности клеточной мембраны на внешнюю поверхность клеточной мембраны. Аннексин-V представляет собой Ca2+-зависимый фосфолипид-связывающий белок с молекулярной массой 35-36 кДа, который может связываться с PS с высокой аффинностью. Используя Аннексин-V, меченный флуоресцеином (FITC, Alexa fluor488 и т. д.), в качестве зонда, апоптотические клетки и живые клетки можно идентифицировать с помощью проточной цитометрии или флуоресцентного микроскопа.

PS некротических клеток также перейдет с внутренней поверхности клеточной мембраны на внешнюю поверхность клеточной мембраны. Аннексин-V также может распознавать PS на поверхности некротических клеток, поэтому Аннексин-V не может отличить некротические клетки от апоптотических клеток. Кроме того, пропидиний йодид (PI) представляет собой краситель нуклеиновой кислоты, который может связываться с ДНК в клетках и не может проникать через всю клеточную мембрану. Клеточная мембрана ранних апоптотических клеток и живых клеток все еще не повреждена, и краситель PI не может свободно проникать в клетку через клеточную мембрану, чтобы связаться с ДНК, поэтому краситель PI не может маркировать апоптотические клетки и живые клетки, но краситель PI может связываться с ДНК в клетке через клеточную мембрану некротических клеток. Краситель PI в мертвых клетках будет испускать красную флуоресценцию после возбуждения лазером 488 нм и будет приниматься соответствующим каналом. Поэтому Аннексин V и PI можно использовать вместе для различения живых клеток, ранних апоптотических клеток и некротических клеток.

Рисунок 2: Анализ результатов проточной цитометрии после двойного окрашивания аннексином-v/pi

Заказ продукции:

2. Ранний апоптоз: окрашивание JC-1 (обнаружение изменений мембранного потенциала митохондрий)

Процесс апоптоза часто сопровождается разрушением митохондриального трансмембранного потенциала, что широко рассматривается как одно из самых ранних событий в процессе каскада апоптоза. Это происходит до появления характеристик ядерного апоптоза (концентрация хроматина, разрыв ДНК). После того, как митохондриальный трансмембранный потенциал разрушается, апоптоз клетки становится необратимым. Существование митохондриального трансмембранного потенциала позволяет некоторым липофильным катионным флуоресцентным красителям, таким как родамин 123, JC-1, JC-10, связываться с митохондриальным матриксом. Увеличение или уменьшение их флуоресценции указывает на увеличение или уменьшение электроотрицательности внутренней мембраны митохондрий.

JC-1 широко используется для определения митохондриального мембранного потенциала △ΨM, показывая потенциал-зависимое накопление в митохондриях. В нормальных митохондриях JC-1 агрегирует в митохондриальном матриксе, образуя полимер, который испускает сильную красную флуоресценцию (ex=585 нм, em=590 нм); В апоптотических клетках митохондриальный трансмембранный потенциал деполяризуется, JC-1 высвобождается из митохондрий, концентрация снижается и возвращается в мономерную форму, испускающую зеленую флуоресценцию. Таким образом, изменение цвета напрямую отражает изменение мембранного потенциала митохондрий. Степень деполяризации митохондрий также можно измерить по соотношению интенсивности красной и зеленой флуоресценции. Обнаружение JC-1 является распространенным методом.

3. Поздний апоптоз: метод TUNEL (метод маркировки фрагментов ДНК in situ)

На поздней стадии апоптоза образуется большое количество липких 3-ОН-терминалов из-за двухцепочечных разрывов или одноцепочечных разрывов хромосомной ДНК. Под действием дезоксирибонуклеотидной терминальной трансферазы (TdT) люциферазный меченый dUTP может быть связан с 3-концом ДНК, так что можно обнаружить апоптотические клетки, такие методы называются опосредованной терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP-мечением конца (TUNEL). Поскольку нормальные или пролиферирующие клетки почти не имеют разрывов ДНК, образование 3-ОН отсутствует, и лишь немногие из них могут быть окрашены. TUNEL на самом деле является методом исследования, объединяющим молекулярную биологию и морфологию. Окрашивание in situ полного одиночного апоптотического ядра или апоптотического тела может точно отражать типичные биохимические и морфологические характеристики апоптоза. Его можно использовать для определения морфологии клеток в парафиновых срезах тканей, замороженных срезах тканей, культивируемых клетках и клетках, выделенных из тканей, а также для обнаружения очень небольшого количества апоптотических клеток. Поэтому его широко используют при изучении апоптоза.

Сопутствующие товары: