Когда клетки подвергаются апоптозу, они активируют ферменты эндонуклеазы, которые разрезают геномную ДНК между нуклеосомами. После того, как ДНК была извлечена во время апоптоза, можно было обнаружить лестницу ДНК длиной 180-200 п.н.
Набор для обнаружения апоптоза TUNEL (TdT-опосредованная dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 640) можно использовать для обнаружения фрагментации ядерной ДНК в позднем апоптотическом процессе клеток тканей. Принцип заключается в том, что под действием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) Alexa Fluor 640-12-DUTP включается в 3´-гидроксильный (3´-OH) конец, обнажаемый во время разрыва геномной ДНК. Таким образом, его можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии. Alexa Fluor 640 — это красный флуоресцентный краситель с высокой стабильностью и яркостью.
Этот набор имеет широкий спектр применения и может использоваться для обнаружения апоптоза в замороженных или парафиновых срезах, а также в культивируемых адгезивных или суспендированных клетках.

Компоненты продукта

Доставка и хранение

Компоненты поставляются с пакетом со льдом и могут храниться при температуре -20°C в течение 1 года.

Предостережения

1. Необходимо приготовить собственный PBS для промывания клеток, антифлуоресцентный гасящий раствор для запечатывания планшетов и 4% параформальдегид для фиксации. Лейкоциты, возможно, придется культивировать в течение длительного времени.
2. Только для исследовательских целей!

Инструкции

1. Подготовка образца
1.1 Залитые парафином срезы тканей
1.1.1.Срезы парафиновой ткани погружали в ксилол на 5 минут при комнатной температуре и повторяли процедуру еще раз для полного удаления парафина.
1.1.2.Замочите срезы в 100% этаноле на 5 минут при комнатной температуре и повторите еще раз.
1.1.3.При комнатной температуре образцы замачивали в градиентном этаноле (90, 80, 70%) в течение 3 минут каждый раз.
1.1.4.Осторожно промойте срезы PBS и тщательно промокните избыток жидкости вокруг образца на предметных стеклах фильтровальной бумагой. В этом случае парафиновую ручку или гидрофобную ручку можно использовать для рисования контура распределения образца вокруг образца, что удобно для последующей обработки проницаемости и балансировки маркировки. Не позволяйте образцу высыхать во время эксперимента. Поместите обработанный образец в мокрую коробку, чтобы образец оставался влажным.
1.1.5.2 мг/мл раствора протеиназы К разбавляли PBS в соотношении 1:100 для достижения конечной концентрации 20 мкг/мл.
1.1.6.К каждому образцу добавляли 100 мкл раствора протеиназы К в концентрации 20 мкг/мл для полного его покрытия и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин.
[Примечания]: Протеиназа К помогает тканям и клеткам стать проницаемыми для окрашивающих реагентов на последующих этапах. Слишком длительное время инкубации увеличит риск отпадания срезов тканей с пластины-носителя на последующих этапах промывки, в то время как слишком короткое время инкубации может привести к недостаточной обработке проницаемости и повлиять на эффективность маркировки. Для получения лучших результатов может потребоваться оптимизировать время инкубации Протеиназы К.
1.1.7.Промыть образец 2-3 раза раствором PBS, аккуратно удалить излишки жидкости и тщательно промокнуть жидкость вокруг образца на предметном стекле фильтровальной бумагой. Обработанный образец помещают во влажную коробку, чтобы сохранить образец влажным.
1.2 Замороженный срез ткани
1.2.1. Удалите замороженные срезы и верните их к комнатной температуре. Предметные стекла были погружены в 4% раствор параформальдегида (растворенный в PBS), зафиксированы и инкубированы в течение 30 мин при комнатной температуре.
1.2.2. Аккуратно удалите излишки жидкости и с помощью фильтровальной бумаги тщательно промокните излишки жидкости вокруг образца на предметном стекле.
1.2.3. Предметные стекла погружали в раствор PBS, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и снова промывали PBS в общей сложности 2 раза.
1.2.4. Аккуратно удалите излишки жидкости и тщательно промокните предметное стекло фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки жидкости вокруг образца. В этом случае парафиновую ручку или гидрофобную ручку можно использовать для рисования контура распределения образца вокруг образца, что удобно для последующей обработки проницаемости и балансировочной операции маркировки. Во время эксперимента не позволяйте образцу высыхать и поместите обработанный образец во влажную коробку, чтобы образец оставался влажным.
1.2.5. Раствор протеиназы К концентрацией 2 мг/мл разбавляли PBS в соотношении 1:100 до достижения конечной концентрации 20 мкг/мл.
1.2.6. К каждому образцу добавляли 100 мкл раствора протеиназы К в концентрации 20 мкг/мл до полного его покрытия и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин.
[Примечания]: Протеиназа К помогает тканям и клеткам быть проницаемыми для окрашивающих реагентов на последующих этапах. Слишком длительное время инкубации увеличит риск отпадания срезов тканей с пластины-носителя на последующих этапах промывки, в то время как слишком короткое время инкубации может привести к недостаточной обработке проницаемости и повлиять на эффективность маркировки. Может потребоваться оптимизировать время инкубации Протеиназы К, если не удалось получить лучшие результаты.
1.2.7. Промойте образец 2–3 раза в открытом стакане с раствором PBS.
[Примечания]: Чтобы избежать потери образца при очистке, рекомендуется не мыть бутылку, а замочить предметные стекла в растворе PBS 2–3 раза для очистки.
1.2.8. Аккуратно удалите излишки жидкости и с помощью фильтровальной бумаги тщательно промокните жидкость вокруг образца на предметном стекле.Обработанный образец помещают во влажный бокс для сохранения влажности образца.
1.3 Подготовка листа обхода ячеек
Прилипшие клетки культивировали на предметных стеклах Lab-Tek Chamber Slides. После индукции апоптоза слайды дважды промывали PBS.
1.4 Приготовление мазков клеток (на примере предметных стекол, покрытых полилизином)
1.4.1. Клетки ресуспендировали в PBS в концентрации около 2×107 клеток/мл, 50-100 мкл клеточной суспензии аспирировали на предметные стекла, покрытые полилизином, и клеточную суспензию осторожно распределяли чистым предметным стеклом.
1.4.2. Клетки фиксировали, а слайды погружали в окрашивающую емкость, содержащую 4% свежеприготовленного параформальдегида в PBS, и помещали при температуре 4 °C на 25 мин.
1.4.3. Предметные стекла промывали, погружали в PBS и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Снова промывали PBS.
1.4.4. Аккуратно удалите излишки жидкости и тщательно промокните предметное стекло фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки жидкости вокруг образца. В этом случае можно использовать парафиновую ручку или гидрофобную ручку, чтобы очертить распределение образца вокруг образца, чтобы облегчить последующую обработку проницаемости и балансировку операций маркировки. Во время эксперимента не позволяйте образцу высыхать и поместите обработанный образец в мокрую коробку, чтобы образец оставался влажным.
1.4.5. Раствор протеиназы К концентрацией 2 мг/мл разбавляли PBS в соотношении 1:100 до достижения конечной концентрации 20 мкг/мл.
1.4.6. К каждому образцу добавляли 100 мкл раствора протеиназы К в концентрации 20 мкг/мл, чтобы полностью покрыть его, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин (его также можно погрузить в 0,2% раствор Тритона X-100, приготовленный в PBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин для исследования проницаемости).
[Примечания]: Протеиназа К помогает тканям и клеткам быть проницаемыми для окрашивающих реагентов на последующих этапах. Слишком длительное время инкубации увеличит риск отпадания срезов тканей с пластины-носителя на последующих этапах промывки, в то время как слишком короткое время инкубации может привести к недостаточной обработке проницаемости и повлиять на эффективность маркировки. Может потребоваться оптимизировать время инкубации Протеиназы К, если не удалось получить лучшие результаты.
1.4.7. Промыть образец 2-3 раза PBS, аккуратно удалить излишки жидкости и тщательно промокнуть жидкость вокруг образца на предметном стекле фильтровальной бумагой. Обработанные образцы помещали во влажную коробку.
2. Этапы обработки ДНКазой положительных контролей
После пропитки образца, Клетки обрабатывали ДНКазой I для приготовления положительных контрольных слайдов. Этот процесс обычно приводит к тому, что большинство клеток обработаны для проявления зеленой флуоресценции.
[Примечания]: Обработка иммобилизованных клеток ДНКазой I приводит к разрыву хромосомной ДНК, в результате чего образуется множество 3'-концов ДНК, которые можно пометить.
2.1. Разбавьте 10× буфер ДНКазы I деионизированной водой в соотношении 1:10 (для каждого образца требуется 200 мкл 1× буфера ДНКазы I, то есть для разбавления требуется 20 мкл 10× буфера ДНКазы I и 180 мкл деионизированной воды). Каплю 100 мкл добавили к проницаемому образцу и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавьте 1 мкл ДНКазы I (1 ед./мкл) к оставшимся 100 мкл 1× буфера ДНКазы I для достижения конечной концентрации 10 ед./мл.
2.2. Жидкость осторожно сливали, затем добавляли 100 мкл буфера, содержащего 10 ед./мл ДНКазы I, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.
2.3. Постучите по предметному стеклу, чтобы удалить излишки жидкости, и тщательно промойте предметное стекло 3–4 раза в емкости с красителем деионизированной водой.
[Примечания]: Для положительных контрольных слайдов необходимо использовать отдельную емкость для окрашивания, в противном случае остаточная ДНКаза I на положительных контрольных слайдах может привести к возникновению высокого фона на экспериментальных слайдах.
3. Маркировка и обнаружение
3.1.Уравновешивающий буфер (5 x Уравновешивающий буфер) разбавляется деионизированной водой в соотношении 1:5 (для каждого образца требуется 100 мкл 1 x Уравновешивающего буфера).
3.2. Буфер уравновешивания (100 мкл 1× буфера уравновешивания) добавляли к каждому образцу для полного уравновешивания области и инкубировали в течение 10-30 мин при комнатной температуре. В качестве альтернативы, поместите слайд в ванну с 1 x буфером уравновешивания, чтобы слайды не уравновешивали образец. Разморозьте смесь для маркировки Alexa Fluor 640-12-dUTP на льду, уравновешивая клетки, и приготовьте достаточно буфера инкубации TdT для всех экспериментов и дополнительных реакций положительного контроля в соответствии с Таблицей 1. Для стандартной реакции с площадью менее 5 см2 объем составляет 50 мкл, и 50 мкл умножают на количество экспериментальных и реакций положительного контроля, чтобы определить общий объем требуемого буфера инкубации TdT. Для образцов с большей площадью поверхности объем реагента можно пропорционально увеличить.

Таблица 1. Инкубационные буферы TdT, приготовленные для экспериментов и дополнительных реакций положительного контроля

[Система отрицательного контроля]: был приготовлен контрольный инкубационный буфер без фермента TdT, а фермент TdT был заменен на ddH2O.
3.3. Большую часть 100 мкл 1×Equilibration Buffer смыли абсорбирующей бумагой вокруг уравновешенной области, а затем добавили 50 мкл LTdT инкубационного буфера на площадь клеток 5 см2. Не позволяйте клеткам высохнуть. После этого предметное стекло следует защитить от света.
3.4. Поместите пластиковое покровное стекло на клетки, чтобы обеспечить равномерное распределение реагентов, и поместите бумажное полотенце, смоченное водой, на дно влажной коробки. Предметные стекла были помещены во влажную коробку и инкубированы при температуре 37 °C в течение 60 мин. Оберните влажную коробку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света.
[Примечания]: Пластиковое покровное стекло можно разрезать пополам перед использованием. Сложите край покровного стекла для удобства снятия и манипуляций.
3.5. Пластиковые покровные стекла были удалены, и срезы были инкубированы в растворе PBS при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем срезы были дважды промыты свежим PBS.
3.6. Аккуратно протрите раствор PBS вокруг и на обратной стороне образца фильтровальной бумагой.
[Примечания]: Чтобы уменьшить фон, после однократной промывки слайдов PBS их можно промыть PBS, содержащим 0,1% Triton X-100 и 5 мг/мл BSA 3 раза по 5 минут каждый раз, чтобы свободные непрореагировавшие маркеры стали прозрачными и чистыми.
3.7. Образцы окрашивали в окрашивающей емкости, а слайды погружали в окрашивающую емкость, содержащую раствор PI (1 мкг/мл, свежеприготовленный и разбавленный PBS), в темноте и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. (Необязательно): Образцы окрашивали в окрашивающей емкости, а слайды погружали в окрашивающую емкость, содержащую раствор DAPI (2 мкг/мл, свежеприготовленный и разбавленный PBS), в темноте и оставляли при комнатной температуре на 5 мин.
3.8.Промойте образец, погрузите предметное стекло в деионизированную воду и оставьте при комнатной температуре на 5 минут. Повторите дважды, чтобы в общей сложности было три промывания.
3.9. Избыток воды на предметном стекле высушили, а в область образца добавили 100 мкл PBS, чтобы образец оставался влажным.
3.10. Образцы немедленно анализировались под флуоресцентным микроскопом, красная флуоресценция Alexa Fluor 640 была обнаружена при 620 нм, а синяя DAPI наблюдалась при 460 нм. DAPI мог окрашивать как апоптотические, так и неапоптотические клетки в синий цвет, и только в апоптотических ядрах Alexa Fluor 640-12-dUTP включался и локализовал красную флуоресценцию. При необходимости слайды можно хранить в течение ночи при 4 °C в темноте.
4. Клетки суспензии были обнаружены методом проточной цитометрии.
4.1. 3~5×106 клеток дважды промывали PBS путем центрифугирования (300×g) при 4 °C, центрифугировали при 300 g при 4 °C в течение 10 мин, а затем ресуспендировали в 0,5 мл PBS.
4.2. Клетки фиксировали, добавляли 5 мл 1% раствора параформальдегида, приготовленного в PBS, и помещали на лед на 20 мин.
4.3. Клетки центрифугировали при 300 × g при 4 ° C в течение 10 мин, и супернатант удаляли и ресуспендировали в 5 мл PBS. Промывку повторяли один раз, и клетки ресуспендировали в 0,5 мл PBS.
4.4. Клетки были проницаемы, и 5 мл предварительно охлажденного льдом 70% этанола было добавлено и инкубировано при -20 ° C в течение 4 часов. Клетки могли храниться в 70% этаноле при -20 ℃ в течение недели, или клетки могли быть проницаемы с 0,2% раствором Triton X-100, приготовленным в PBS и хранящимся при комнатной температуре в течение 5 минут.
4.5. Клетки центрифугировали при 300 × g в течение 10 мин и ресуспендировали в 5 мл PBS. Центрифугирование повторяли и ресуспендировали в 1 мл PBS.
4.6. Перенесите 2 × 106 клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
4.7. Уравновешивание центрифугировали при 300 × g в течение 10 мин, и супернатант удаляли и ресуспендировали с 80 мкл 1 × буфера для уравновешивания. Инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин.
4.8. Во время балансировки клеток смесь для маркировки Alexa Fluor 640-12-dUTP расплавляли на льду и готовили достаточное количество инкубационного буфера TdT для всех реакций в соответствии с таблицей 1. Для стандартной реакции 2 × 106 клеток объем составлял 50 мкл, и 50 мкл умножали на количество реакций, чтобы определить общий объем необходимого инкубационного буфера TdT.
4.9. Клетки центрифугировали при 300 × g в течение 10 мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 50 мкл инкубационного буфера TdT и инкубировали при 37℃ в течение 60 мин, защищая от света. Клетки аккуратно ресуспендировали каждые 15 мин с помощью микропипетки.
4.10. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 20 мМ ЭДТА и осторожным перемешиванием микропипеткой.
4.11. После центрифугирования при 300g в течение 10 мин супернатант был отброшен, а осадок был ресуспендирован в 1 мл 0,1% раствора Triton X-100, приготовленного в PBS, содержащем 5 мг/мл BSA. Раствор был повторен один раз и промыт дважды в общей сложности.
4.12. Клетки анализировали методом проточной цитометрии и измеряли красную флуоресценцию Alexa Fluor 640 при 620 нм.