Набор для обнаружения апоптоза клеток Annexin V-EGFP/PI использует аннексин V, меченный EGFP, в качестве зонда для обнаружения возникновения раннего апоптоза клеток.
Принцип обнаружения следующий: в нормальных живых клетках фосфотидилсерин (ФС) находится на внутренней стороне клеточной мембраны, но в ранних апоптотических клетках ФС переходит с внутренней стороны клеточной мембраны на поверхность клеточной мембраны и подвергается воздействию внеклеточной среды. Аннексин-V представляет собой Ca²⁺ -зависимый фосфолипид-связывающий белок с молекулярной массой от 35 до 36 кДа, который связывается с PS с высокой аффинностью. Фосфатидилсерин может связываться с мембраной ранних апоптотических клеток через экспонированный фосфатидилсерин на внешней стороне клетки.
Кроме того, пропидий йодид (PI) используется для различения выживших ранних клеток от некротических или поздних апоптотических клеток. PI — это краситель нуклеиновой кислоты, который не может проходить через неповрежденную клеточную мембрану нормальных клеток или ранних апоптотических клеток, но может проходить через клеточную мембрану поздних апоптотических и некротических клеток и окрашивать ядро ​​в красный цвет. Таким образом, когда Аннексин V был объединен с PI, PI был исключен из живых клеток (Аннексин V^-/ПИ^-) и ранние апоптотические клетки (Аннексин V⁺/ПИ^-). Поздние апоптотические и некротические клетки были дважды положительными как для EGFP, так и для PI (Аннексин V⁺/ПИ⁺).
Этот набор подходит для проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

Компоненты продукта

Доставка и хранение

Компоненты поставляются с пакетом со льдом и могут храниться при температуре -20°C в защищенном от света месте, а также не допускать повторного замораживания и размораживания в течение 1 года.
[Примечание]: Если его необходимо использовать повторно в течение короткого периода времени, его можно хранить при температуре 4 ℃ в защищенном от света месте в течение полугода.

Предостережения

1) Поскольку апоптоз — быстрый процесс, рекомендуется проводить анализ образцов в течение 1 часа после окрашивания.
2) Для адгезивных клеток переваривание является критическим шагом. Не используйте ЭДТА в пищеварительном растворе, так как ЭДТА может повлиять на связывание аннексина V с PS.
3) Для фиксации клеток, например, для одновременного обнаружения апоптоза и клеточного цикла следует использовать Annexin V-FITC, но не Annexin V-EGFP, поскольку EGFP денатурируется и теряет способность возбуждать флуоресценцию во время фиксации. Клетки инкубировали с Annexin V-FITC перед фиксацией, а несвязанный Annexin V-FITC смывали буфером Binding Buffer.Поскольку повышенная проницаемость клеток во время фиксации приводит к образованию клеточных остатков, которые могут связываться с аннексином V и влиять на результаты.
4) Если образец взят из крови, обязательно удалите из крови тромбоциты. Поскольку тромбоциты содержат PS, который может связываться с аннексином V, влияя на результаты. Тромбоциты можно вымыть с помощью буферного агента, содержащего ЭДТА, и центрифугирования при 200 g.
5) Перед тем как открыть крышку, слегка центрифугируйте реагент и вылейте жидкость с внутренней стенки крышки на дно пробирки, чтобы избежать разбрызгивания жидкости при открытии крышки.
6) Аннексин V-EGFP и PI являются светочувствительными веществами, поэтому во время работы избегайте воздействия света.
7) Только для исследовательских целей!

Инструкции

Экспериментальный дизайн
Пустая пробирка: Для регулирования напряжения использовали клетки отрицательного контроля без аннексина V-EGFP и окрашивающего раствора PI.
Пробирки с одиночным окрашиванием: для модуляции компенсации использовали клетки положительного контроля, дополненные только аннексином V-EGFP.
Детектирующая трубка: Клетки обрабатывались Annexin V-EGFP и PI Staining Solution. Экспериментальные данные были получены путем корректировки параметров пустой трубки и трубки с одним красителем.
1.1 Окрашивание образцов
1) суспензионная ячейка: Клетки собирали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при температуре 4 °C.
Адгезивные клетки: После обработки трипсином без ЭДТА клетки собирали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при температуре 4 °C. Время обработки трипсином не должно быть слишком длительным, чтобы избежать ложноположительных результатов.
2) Клетки дважды промывали предварительно охлажденным PBS, каждый раз при 300 g, и центрифугировали при 4 ℃ в течение 5 минут.
3) Клетки ресуспендировали в 1× связывающем буфере и доводили концентрацию до 1~5 ×106/мл.
4) 100 мкл клеточной суспензии добавляли в пробирки для проточной цитометрии объемом 5 мл, добавляли 5 мкл аннексина V-EGFP, клетки перемешивали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре под светом.
5) Добавляли 10 мкл раствора PI и 400 мкл PBS, окрашивание проводили немедленно.
[Примечания]: При использовании проточной цитометрии для обнаружения апоптоза PI сильно зависит от времени, и слишком длительное время приведет к увеличению окрашивания PI, поэтому проточную цитометрию следует завершить в течение 1 часа.
1.2 Анализ методом проточной цитометрии
Максимальная длина волны возбуждения EGFP составила 488 нм, а максимальная длина волны испускания — 507 нм; Максимальная длина волны возбуждения комплекса PI-ДНК составила 535 нм, а максимальная длина волны испускания — 615 нм. Для анализа использовалось программное обеспечение, такое как CellQuest, и был нарисован двухцветный точечный график, EGFP — это абсцисса, а PI — ордината. Соберите 10 000 событий на образец. В типичном эксперименте клетки можно разделить на три подгруппы: живые клетки имеют только очень слабую фоновую флуоресценцию, ранние апоптотические клетки имеют только сильную зеленую флуоресценцию, а поздние апоптотические клетки имеют двойное окрашивание зеленой и красной флуоресценцией.