Принцип обнаружения набора для обнаружения апоптоза Annexin V-Alexa Fluor488/PI заключается в следующем: в нормальных живых клетках фосфотидилсерин (PS) находится на внутренней стороне клеточной мембраны, но в ранних апоптотических клетках PS переходит с внутренней стороны клеточной мембраны на поверхность клеточной мембраны и подвергается воздействию внеклеточной среды. Аннексин-V представляет собой Ca²⁺ -зависимый фосфолипидсвязывающий белок с молекулярной массой от 35 до 36 кДа, который с высокой аффинностью связывается с ФС и связывается с клеточной мембраной ранних апоптотических клеток через фосфатидилсерин, экспонированный на внешней стороне клетки.
Кроме того, пропидий йодид (PI) используется для различения выживших ранних клеток от некротических или поздних апоптотических клеток. PI — это краситель нуклеиновой кислоты, который не может проходить через неповрежденную клеточную мембрану нормальных клеток или ранних апоптотических клеток, но может проходить через клеточную мембрану поздних апоптотических и некротических клеток и окрашивать ядро ​​в красный цвет. Таким образом, когда Аннексин V был объединен с PI, PI был исключен из живых клеток (Аннексин V^-/ПИ^-) и ранние апоптотические клетки (Аннексин V⁺/ПИ^-). Напротив, поздние апоптотические и некротические клетки были дважды положительными для Alexa Fluor488 и PI (Annexin V⁺/ПИ⁺).

Компоненты продукта

Доставка и хранение

Компоненты поставляются с пакетом со льдом и могут храниться при температуре -20°C в течение 1 года.

Предостережения

1) Поскольку апоптоз — быстрый процесс, рекомендуется проводить анализ образцов в течение 1 часа после окрашивания.
2) Для адгезивных клеток переваривание является критическим шагом. Не используйте ЭДТА в пищеварительном растворе, так как ЭДТА может повлиять на связывание аннексина V с PS.
3) Если образец взят из крови, обязательно удалите из крови тромбоциты. Поскольку тромбоциты содержат PS, который может связываться с аннексином V, влияя на результаты. Можно использовать буферный агент, содержащий EDTA, и смыть тромбоциты центрифугированием при 200 g.
4) Перед тем как открыть крышку, слегка центрифугируйте реагент и вылейте жидкость с внутренней стенки крышки на дно пробирки, чтобы избежать разбрызгивания жидкости при открытии крышки.
5) Аннексин V-Alexa Fluor488 и PI являются светочувствительными веществами и при работе с ними следует хранить в защищенном от света месте.
6) Только для исследовательских целей!

Инструкции

1.1 Образец крашения
1.а) суспензионная ячейка: Клетки собирали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при температуре 4°C.
б) адгезивная клетка: после обработки трипсином без ЭДТА клетки собирали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при 4 °C. Время обработки трипсином не должно быть слишком длительным, чтобы избежать ложноположительных результатов.
2. Клетки дважды промывали PBS, предварительно охлажденным до 4 °C, каждый раз используя 300 g, и центрифугировали при 4 °C в течение 5 минут.
3. Клетки ресуспендировали, добавляя 250 мкл 1× связывающего буфера, и доводили концентрацию до 1×106/мл.
4. 100 мкл клеточной суспензии добавили в пробирку для проточной цитометрии объемом 5 мл, добавили 5 мкл Annexin V-Alexa Fluor 488 и 10 мкл PI и осторожно перемешали.
5. Реакционную смесь хранили в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 15 мин.
6. Добавляли 400 мкл 1× связывающего буфера, перемешивали, и образцы детектировали методом проточной цитометрии в течение 1 часа.
[Примечания]: Чтобы избежать потери клеток во время промывания, можно использовать небольшой наконечник для аспирации жидкости.
1.2 Анализ методом проточной цитометрии
Alexa Fluor488 имеет максимальную длину волны возбуждения 488 нм и максимальную длину волны испускания 519 нм; максимальная длина волны возбуждения комплекса PI-ДНК составила 535 нм, а максимальная длина волны испускания 615 нм. CellQuest и другое программное обеспечение использовались для анализа и построения двухцветного точечного графика с Alexa Fluor488 в качестве абсциссы и PI в качестве ординаты. Соберите 10 000 событий на образец.
1.3 Анализ флуоресцентной микроскопии
1) Нанесите каплю суспензии клеток, дважды окрашенной аннексином V-FITC/PI, на предметное стекло и накройте клетки покровным стеклом.
2) Наблюдалось под флуоресцентным микроскопом с двухцветным фильтром. Сигнал флуоресценции аннексина V-FITC был зеленым, а сигнал флуоресценции PI - красным.