1.Предисловие
Макрофаги — это крупные фагоциты, отличающиеся от моноцитов в крови. Они присутствуют почти во всех тканях, особенно в тех, которые часто контактируют с внешним миром, например, в коже, легких и кишечнике. Макрофаги играют жизненно важную роль во многих биологических процессах, таких как иммунная защита человека, воспалительная реакция, восстановление тканей, иммунная регуляция и развитие заболеваний.
Первичные макрофаги человека трудно изолировать из тканей в достаточном количестве, и они не размножаются в культуре. Макрофаги, полученные из моноцитов, представляют собой прекрасную альтернативу, поскольку моноциты в крови человека легко получить в больших количествах и могут быть дифференцированы в макрофаги in vitro.
2.Биологические функции макрофагов
- Фагоцитоз
Макрофаги распознают и поглощают патогены и остатки мертвых клеток через рецепторы на своей поверхности. Этот процесс не только помогает устранить инфекцию, но и предотвращает накопление этих веществ в организме, что может вызвать воспаление или другие проблемы.
- Защита от патогенов
Макрофаги борются с патогенами, вырабатывая химические вещества, убивающие микроорганизмы, такие как активный кислород и оксиды азота, а также цитокины и хемокины, которые регулируют воспалительные реакции.
- Регуляция воспаления
Макрофаги играют сложную роль в воспалительных реакциях. Они могут не только способствовать воспалению, высвобождая провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкин 1 (IL-1), но и подавлять воспаление, вырабатывая противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и TGF-β.
- Восстановление и реконструкция тканей
После воспалительной реакции макрофаги помогают восстанавливать и регенерировать ткани, выделяя различные факторы роста. Они очищают остатки повреждений, одновременно способствуя образованию новых тканей.
- Иммуномодуляция
Макрофаги способствуют специфическим иммунным реакциям, представляя антигены Т-клеткам. В то же время они регулируют другие компоненты иммунной системы, секретируя различные цитокины, например, регулируя активность Т-клеток и В-клеток.
- Связь с болезнями
Макрофаги играют важную роль в развитии многих заболеваний, включая инфекционные заболевания, аутоиммунные заболевания, опухоли и хронические воспалительные заболевания, такие как атеросклероз.
3. Классификация макрофагов
В зависимости от состояния активации и функции макрофаги можно разделить на две основные категории: M1 и M2. Эти два подтипа играют разные роли в регуляции иммунного ответа и воспаления.
Макрофаги М1
Макрофаги M1 в основном стимулируются цитокинами, такими как интерферон гамма (IFN-γ) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), и обладают провоспалительными характеристиками. Они обладают сильной антимикробной активностью, могут продуцировать свободные радикалы кислорода и воспалительные факторы, а также участвуют в уничтожении и уничтожении патогенных микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы.
Макрофаги М1 участвуют в иммунной защите организма и воспалительном ответе, способствуют инфильтрации воспалительных и иммунных клеток, помогают очищать инфицированные и поврежденные ткани, а также способствуют возникновению и поддержанию иммунных воспалительных реакций.
Макрофаги М2
Макрофаги M2 в основном стимулируются цитокинами, такими как интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13), и обладают противовоспалительными и восстановительными свойствами. Они участвуют в процессах восстановления и регенерации тканей, способствуют противовоспалительным реакциям и иммунной регуляции.
Макрофаги М2 играют важную роль на поздней стадии воспаления и восстановления тканей, способствуют разрешению воспаления и восстановлению тканей, регулируют баланс иммунных реакций и способствуют регенерации и восстановлению тканей.
Рисунок 1. Сводка основных состояний поляризации макрофагов активированных макрофагов [1]
4. Выделение, культивирование и дифференциация макрофагов in vitro
4.1 Метод разделения
- Выделение из периферической крови
Выделение моноцитов: Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяются с помощью центрифугирования в градиенте плотности (например, Ficoll-Paque). Образец крови добавляется в верхний слой Ficoll, и после центрифугирования моноциты располагаются между слоями плазмы и Ficoll.
Изоляция макрофагов: После того, как моноциты изолированы от PBMC, мононуклеарные клетки-предшественники могут быть дополнительно изолированы с помощью пластиковой адгезии. Моноциты культивируются в пластиковых чашках для культивирования в течение нескольких часов, неприкрепившиеся клетки удаляются, а оставшиеся прикрепившиеся клетки в основном являются мононуклеарными клетками-предшественниками.
- Изоляция из тканей
Образцы тканей разделяются на суспензии отдельных клеток путем механической и/или ферментативной обработки (например, коллагеназой и ДНКазой). Нецелевые клетки удаляются центрифугированием в градиенте плотности или негативным отбором (с использованием антител и магнитных шариков), а макрофаги собираются.
4.2 Метод культивирования
Обычно используемые питательные среды включают RPMI 1640 или IMDM, которые обычно необходимо дополнять 10% сыворотки плода быка (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина и необходимыми факторами роста. Условия культивирования обычно находятся в инкубаторе при 37°C и 5% CO2
4.3 Метод индукции дифференциации
- Дифференциация из мононуклеарных клеток-предшественников
Использование M-CSF: Добавьте в культуральную среду фактор стимуляции колоний макрофагов (M-CSF), обычно в концентрации 20–50 нг/мл, и продолжайте культивирование в течение 7–10 дней, чтобы вызвать дифференциацию мононуклеарных клеток-предшественников в макрофаги.
Использование ГМ-КСФ: Фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов и макрофагов (ГМ-КСФ), также может индуцировать дифференциацию макрофагов, особенно тенденцию к образованию макрофагов М1 (провоспалительных).
- Дальнейшая регуляция фенотипа и функции
Макрофаги М1: может быть вызван путем добавления в культуральную среду IFN-γ (интерферона-γ) и LPS (липополисахарида).
Макрофаги М2: может быть вызвано добавлением противовоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-4 и ИЛ-13.
Эти методы позволяют исследователям изучать различные биологические функции макрофагов и их поведение в патологических условиях in vitro. Конкретные рабочие условия каждого этапа (такие как плотность клеток, время культивирования, концентрация добавленных факторов и т. д.) могут потребовать оптимизации в соответствии с конкретной целью эксперимента.
Таблица 1.Культура макрофагов и условия индукции
| Источник клеток | Питательная среда | Первоначальные дополнения | M1 поляризация | M2 поляризация |
| THP-1Cell | РПМИ 1640 | 100 нг/мл ПМА | 20 нг/мл IFN-γ 100 нг/мл ЛПС | 20 нг/мл ИЛ-4 20 нг/мл ИЛ-13 |
| Моноциты | РПМИ 1640 | M1:50 нг/мл ГМ-КСФ M2: 50 нг/мл M-CSF | 10 нг/мл ЛПС 50 нг/мл IFN-γ | M2a: 20 нг/мл ИЛ-4 M2b: IgG+ЛПС M2c: 20 нг/мл TGF-β1 или 10 нг/мл IL-10. |
| Мстрелка | ИМДМ | 10-50 нг/мл M-CSF | 100 нг/мл ЛПС (можно добавить 50 нг/мл IFN-γ) | 10 нг/мл ИЛ-4 (можно добавить 10 нг/мл ИЛ-13) |
| РАW264.7 Ячейка | ДМЭМ | / | 100 нг/мл ЛПС | 20 нг/мл IL-4 (можно добавить 20 нг/мл IL-10)） |
5.Данные анализа
YEASEN предлагает серию высокоактивных цитокиновых продуктов HiActive®, связанных с культурой макрофагов, для поддержки исследований макрофагов.
Высокоактивные цитокины HiActive®：Биологическая активность каждого цитокина была проверена для обеспечения его высокой активности.
Данные проверки активности:
Рекомбинантный мышиный белок M-CSF
Фигура 1. Измерено в анализе пролиферации клеток с использованием мыши M‑NFS‑60 Клетки лимфобластов миелогенного лейкоза. ED50 для этого эффекта обычно составляет 16,74 -25,83 нг/мл.
Рекомбинантный Мышиный ГМ-КСФ Белок
Фигура 2.ED50 по данным анализа пролиферации клеток с использованием мышиных клеток FDC-P1, составляет 2,79–12,84 пг/мл.
Рекомбинантный Человеческий ИЛ-10 Белок
Фигура 3ED50, определенный с помощью анализа пролиферации клеток с использованием мышиных клеток MC/9 составляет менее 0,1 нг/мл, что соответствует удельной активности > 1,0×107 МЕ/мг.
Сопутствующие товары
| Классификация | Разновидность | Кот | Спецификация |
| Г-КСФ | Человек | 2 мкг/10 мкг/50 мкг/100 мкг | |
| Мышь | 2 мкг/ 10 мкг/ 50 мкг/ 100 мкг/ 500 мкг | ||
|
М-КСФ | Человек | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Мышь | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | ||
|
ГМ-КСФ | Человек | 5 мкг/50 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Мышь | 10 мкг/100 мкг/ 500 мкг | ||
| ИФН-γ | Человек | 20 мкг/50 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Мышь | 5 мкг/50 мкг/100 мкг/500 мкг | ||
| ИЛ-4 | Человек | 5 мкг/50 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Мышь | 5 мкг/ 100 мкг/ 500 мкг | ||
| Ил-10 | Человек | 2 мкг/ 10 мкг/ 50 мкг/ 100 мкг/ 500 мкг | |
| Мышь | 2 мкг/ 10 мкг/ 50 мкг/ 100 мкг/ 500 мкг | ||
| Ил-13 | Человек | 2 мкг/ 10 мкг/ 50 мкг/ 100 мкг/ 500 мкг | |
| Мышь | 2 мкг/ 10 мкг/ 50 мкг/ 100 мкг/ 500 мкг |
Ссылки
[1] Атри С, Герфали ФЗ, Лауини Д.Роль поляризации макрофагов человека в воспалении при инфекционных заболеваниях. Int J Mol Sci. 2018 19 июня;19(6):1801.