1.Предыстория Ламинина 521
Ламинин 521 (LN521) является ключевым белком клеточной адгезии в нише естественных стволовых клеток и матрицей для культивирования и расширения человеческих эмбриональных (hES) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). LN521 связывается с рецепторами клеточной поверхности и активирует сигнальные пути клеток, что приводит к образованию более функциональных клеток.
Laminin 521 воспроизводит биологически релевантную среду hPSC in vitro, способствует прикреплению, высокой выживаемости и сильному долгосрочному самообновлению hPSC и является ключевым матричным белком, который поддерживает рост стволовых клеток и сохраняет стабильность структуры и производительности базальной мембраны. Laminin 521 также является одной из наиболее часто используемых матриц для культивирования без питательных веществ. Кроме того, Laminin 521 может обеспечить эффективное пассирование отдельных клеток генетически стабильных и плюрипотентных стволовых клеток без добавления каких-либо ингибиторов апоптоза. Клетки растут в однородном монослое без необходимости вручную удалять какие-либо области дифференциации. Кроме того, исследования показали, что LN521 может поддерживать рост PSC в течение более 10 поколений без каких-либо признаков аномалий кариотипа и сохраняет способность PSC дифференцироваться в три зародышевых слоя: внутренний, средний и внешний зародышевые слои.
Рисунок 1. Структура ламинина 521 [1]
2.Эксперимент с покрытием ламинином
2.1 Подготовьте ламинин 521 до 400 мкг/мл стерильной деионизированной водой или водой для инъекций. Перед использованием рекомендуется дополнительно разбавить до 100 мкг/мл стерильным 1×DPBS (Ca++/Mg++), а затем разбавить до рабочей концентрации 5-10 мкг/мл стерильным DPBS (Ca++/Mg++). Концентрация покрытия варьируется в зависимости от типа культивируемых клеток, и рекомендуется оптимизировать экспериментальный протокол, чтобы определить оптимальную концентрацию покрытия для клеток. Рекомендуемые концентрации см. в Таблице 1.
Примечание: DPBS, содержащий Ca2+ и Мг2+ следует использовать, поскольку двухвалентные катионы важны для структуры и функции белка. Требуемая рабочая концентрация Laminin 521 зависит от клеток и применения. Мы рекомендуем начальную концентрацию покрытия 0,5 мкг/см2.
Таблица 1. Рекомендуемые объемы рабочего раствора рекомбинантного человеческого ламинина для различных культуральных сосудов.
| чашка Петри | Концентрация покрытия (мкг/мл) | Сумма добавления LN521 | Сумма добавления 1*DPBS | Общий объем |
| 6 скважин | 5 | 50 мкл/лунку | 950 мкл/лунку | 1 мл/лунку |
| 12 скважин | 5 | 25 мкл/лунку | 475 мкл/лунку | 0,5 мл/лунку |
| 24 скважины | 5 | 15 мкл/лунку | 285 мкл/лунку | 0,3 мл/лунку |
| 48 скважин | 5 | 7,5 мкл/лунку | 142,5 мкл/лунку | 150 мкл/лунку |
| 96 скважин | 5 | 3,5 мкл/лунку | 66.5 мкл/лунку | 70 мкл/лунку |
| Чашка Петри 35 мм | 5 | 50 мкл/лунку | 950 мкл/лунку | 1 мл/лунку |
| Чашка Петри 60 мм | 5 | 100 мкл/лунку | 1900 мкл/лунку | 2 мл/лунку |
| Чашка Петри 100 мм | 5 | 300 мкл/лунку | 5700 мкл/лунку | 6 мл/лунку |
Указанный выше объем рассчитан с учетом концентрации покрытия 5 мкг/мл.
2.2 Добавьте указанный объем смеси ламинина-DPBS в каждую лунку и осторожно встряхните. Убедитесь, что вся поверхность покрыта раствором для покрытия ламинином, так как непокрытые поверхности не поддерживают рост клеток.
2.3. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37°C и инкубируйте в течение ночи. Минимальное время инкубации составляет 2 часа, но рекомендуется инкубация в течение ночи для получения идеальных условий для культивирования клеток. Будьте осторожны, чтобы не дать контейнеру для культивирования высохнуть, что приведет к инактивации LN521.
2.4. Когда клетки будут готовы к посеву, аспирируйте раствор ламинина 521.
3.Культура iPSC
3.1 Размораживание iPSC (на примере 12-луночного планшета)
3.1.1 Извлеките iPSC из жидкого азота или сухого льда и разморозьте в воде при температуре 37°C в течение 10 секунд.
3.1.2 Простерилизуйте криопробирки 75% спиртом и перенесите их на рабочую поверхность.
3.1.3 Перенесите клетки в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DMEM‑F12.
3.1.4 Центрифугируйте центрифужную пробирку объемом 15 мл при 300 g в течение 5 минут при комнатной температуре.
3.1.5 Удалите раствор ламинина из покрытого 12-луночного планшета.
3.1.6 Удалите супернатант клеток и осторожно ресуспендируйте iPSC в 1 мл mTeSR-plus (содержащем 10 мкМ Y-27632) и перенесите их в покрытый 12-луночный планшет. Встряхните планшет, чтобы равномерно распределить клетки до конечной плотности клеток 1×10^5 клеток/лунку, и дайте постоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Убедитесь, что культура пассируется в течение 4-5 дней.
3.1.7 Верните 12-луночный планшет в инкубатор при температуре 37°C для инкубации.
3.1.8 Питательную среду, содержащую ингибитор ROCK, следует удалить через 12–16 часов и продолжить культивирование в среде без ингибитора.
Таблица 2. Плотность засева клеток в различных культуральных сосудах, количество клеток определялось в зависимости от скорости роста клеток
| Сосуды для культивирования клеток | 6 скважин | 12 скважин | 24 скважины | 96 скважин |
| Номер сотового | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. Протокол пассажа iPSC
3.2.1 Удалите культуральный супернатант и промойте 1 мл PBS (Ca‑‑/мг‑‑).
Примечание: Используйте PBS без Ca2+ и Mg2+, так как двухвалентные катионы оказывают отрицательное воздействие на некоторые ферменты диссоциации.
3.2.2 Удалите PBS и добавьте 0,5 мл реагента для мягкой диссоциации клеток.Инкубируйте при комнатной температуре в течение 6–8 минут или наблюдайте под микроскопом до тех пор, пока клетки не перестанут быть связанными с пластиной.
3.2.3 Добавьте равный объем DMEM-F12, осторожно перемешайте клетки, перенесите в центрифужную пробирку при комнатной температуре и центрифугируйте при 300 g в течение 5 минут.
3.2.4 Перед пассированием клеток подготовьте 12-луночный планшет, покрытый ламинином.
3.2.5 Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в среде mTeSR‑plus, содержащей 10 мкМ Y‑27632.
3.2.6 Перенесите клетки в подготовленный ламининовый 12-луночный планшет. Аккуратно встряхните планшет, чтобы равномерно распределить клетки, и оставьте при комнатной температуре на 10–20 минут.
3.2.7 Поместите 12-луночный планшет в инкубатор при температуре 37°C и инкубируйте.
Примечание: iPSC быстро дифференцируются и умирают после того, как вырастут в монослой. Для поддержания роста и плюрипотентности их необходимо пассировать до того, как они станут конфлюэнтными.
3.3 Криоконсервация iPSC
3.3.1 Подготовьте реагент для щадящей диссоциации клеток.
3.3.2 Проведите разделение клеток в соответствии с протоколом пассирования iPSC, используйте подсчет клеточных органелл для обеспечения плотности клеток перед криоконсервацией.
3.3.3 Каждая пробирка с клетками должна быть заморожена при плотности клеток 1-2×10^6. Следуйте этапам центрифугирования и удаления среды для культивирования клеток в протоколе пассирования iPSC. Ресуспендируйте изолированный осадок iPSC в соответствующем объеме раствора для криоконсервации.
3.3.4 Добавьте 1 мл ресуспендированного клеточного криоконсервированного осадка в криоконсервирующую пробирку объемом 1,5 мл, выполните программное охлаждение, а затем перенесите в жидкий азот для длительного хранения.
4.Важные замечания по ламининовому покрытию
4.1 Все этапы экспериментального протокола должны выполняться в стерильных условиях.
4.2. Избегайте длительного воздействия комнатной температуры на ламинин.
4.3. Избегайте повторного замораживания и размораживания.
4.4. После размораживания неразбавленный исходный раствор белка можно хранить при температуре 2~8℃ в стерильных условиях и сохранять стабильность в течение не менее 3 месяцев.
5.Сопутствующая информация о продукте
| Название продукта | Кот# | Размер |
| Рекомбинантный человеческий белок ламинин 521 (неживотного происхождения) | 92602ES | 10мкг/100мкг/500мкг/1мг |
6.Ссылки
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Кристаллографический анализ короткого плеча ламинина β2 показывает, как домен LF вставляется в регулярный массив доменов LE. Matrix Biol. 2017 Январь;57-58:204-212.