Пуромицин — аминогликозидный антибиотик, вырабатываемый Streptomyces alboniger. Он является аналогом 3'-конца молекулы аминоацил-тРНК и может связываться с сайтом A рибосомы, встраиваясь в расширяющуюся пептидную цепь, нарушая транслокацию пептида на рибосоме, вызывая преждевременное завершение цепи во время трансляции и, таким образом, ингибируя синтез белка.
Рисунок 1. Структурная формула пуромицина (CAS № 53-79-2)
Ген pac, кодирующий пуромицин N-ацетилтрансферазу (pac), был обнаружен в бактерии Streptomyces alboniger, продуцирующей пуромицин, что придает ей устойчивость к пуромицину. Эта характеристика в настоящее время широко используется для скрининга стабильных трансфицированных клеточных линий млекопитающих, несущих плазмиды с геном pac. Широкое использование пуромицина при скрининге стабильных клеточных линий связано с характеристиками лентивирусных векторов, большинство из которых несут ген pac в коммерческих лентивирусных векторах. В некоторых особых случаях пуромицин также может использоваться для скрининга штаммов E. coli, трансформированных плазмидами, несущими ген pac. Пуромицин действует быстро и может быстро вызывать гибель клеток при низких концентрациях. Адгезивные клетки млекопитающих чувствительны к концентрациям 2-5 мкг/мл пуромицина, тогда как суспензионные клетки уже чувствительны к концентрациям пуромицина всего 0,5-2 мкг/мл. Клетки млекопитающих со стабильной устойчивостью к пуромицину могут быть получены в течение недели.
Скрининг стабильной клеточной линии
Экспериментальный принцип
Путем клонирования экзогенной ДНК/shRNA в вектор, несущий ген pac, рекомбинантный вектор трансфицируется в клетки-хозяева и интегрируется в их хромосомы, стабильно передается при делении клеток и, наконец, скринируется с помощью пуромицина.
Подготовка и предварительный эксперимент
1 Рекомендуемые концентрации использования
Клетки млекопитающих: 1–10 мкг/мл, оптимальную концентрацию необходимо определить в ходе предварительного эксперимента.
E.coli: Для скрининга стабильно трансформированных E. coli, несущих ген pac на среде LB-агара, используйте концентрацию 125 мкг/мл. Для скрининга стабильных трансформантов E. coli с помощью пуромицина требуется точная регулировка pH.
2 Метод растворения
Растворите пуромицин в дистиллированной воде, чтобы приготовить исходный раствор с концентрацией 50 мг/мл, профильтруйте стерилизовать через фильтр 0,22 мкм, разделите на аликвоты и храните при температуре -20 °C.
3. Определение кривой уничтожения пуромицина (на примере трансфекции shRNA или лентивирусной трансдукции)
Эффективная концентрация скрининга пуромицина связана с типом клеток, статусом роста, плотностью клеток, метаболизмом клеток и положением клеточного цикла. Крайне важно определить минимальную концентрацию пуромицина, которая убивает нетрансфицированные клетки. Крайне важно провести предварительный эксперимент по скринингу градиента пуромицина для первого эксперимента, чтобы установить кривую гибели.
- Клетки пластины с плотностью 5~8×104клетки/лунку в 24-луночном планшете и культивировать в течение ночи.
- Подготовьте среду для скрининга: свежая среда, содержащая различные концентрации пуромицина (например, 0–15 мкг/мл, не менее 5 градиентов).
- Замените среду на свежеприготовленную, продолжайте культивирование и наблюдайте за ростом клеток, меняя свежую среду каждые 2–3 дня.
- Ежедневно наблюдайте за выживаемостью клеток; минимальной концентрацией препарата является концентрация, которая эффективно убивает все нетрансфицированные клетки в течение 4–6 дней.
Скрининг стабильных трансфектантов
- После лентивирусной инфекции в течение 48–72 ч (70–80% слияния) культивируйте клетки в среде, содержащей соответствующую концентрацию пуромицина, в течение не менее 48 ч. Когда все клетки в контрольной группе, не трансфицированной пуромицином, погибают, все оставшиеся клетки в группе, инфицированной вирусом, являются положительными клетками.
【Примечание】: ① Эффект антибиотиков наиболее выражен, когда клетки находятся в активной фазе деления. Эффективность антибиотиков будет значительно снижена, если клетки слишком плотные. Плотность клеток не должна превышать 25%. ② Ежедневно наблюдайте за статусом роста клеток; скрининг пуромицина требует не менее 48 часов, а эффективная концентрация скрининга пуромицина обычно длится от 3 до 10 дней. Чем выше MOI вируса, тем больше копий shRNA и гена устойчивости к пуромицину содержит каждая клетка. При проведении скрининга пуромицина, чем выше MOI, тем больше копий pac содержат клетки, и тем более высокую концентрацию пуромицина они могут переносить. Отрегулируйте концентрацию пуромицина для скрининга трансфицированных клеток, но концентрация пуромицина не должна быть ниже минимальной эффективной концентрации кривой уничтожения;
- Добавьте питательную среду, содержащую минимальную концентрацию пуромицина, для увеличения количества клеток, и после подтверждения результатов ПЦР-теста приступайте к криоконсервации.
| Продуктс имя | Кот# | Спецификация | Появление |
| Пуромицин Дигидрохлорид КАС:58-58-2 | 60210ES25 | 25 мг | Белый или белый порошок |
| 60210ES60 | 100 мг | ||
| 60210ES72 | 250 мг | ||
| 60210ES76 | 500 мг | ||
| 60210ES80 | 1 г | ||
| Пуромицин (Раствор 10 мг/мл) КАС:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 мл | Раствор (10 мг/мл в H2О) |
| 60209ES50 | 5×1 мл | ||
| 60209ES60 | 10×1 мл | ||
| 60209ES76 | 50×1 мл |
Рекомендация по продукту
Публикации клиентов, использующих этот продукт (частичная статистика: некоторые)
[1] Чжан Д., Лю И., Чжу И. и др. Неканонический путь cGAS -STING-PERK облегчает трансляционную программу, критическую для старения и фиброза органов. Нат Клеточная Биология . 2022;24(5):766-782. doi:10.1038/s41556-022-00894-z (IF:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J и др. CD73 в небольших внеклеточных везикулах, полученных из HNSCC, определяет иммуносупрессию, связанную с опухолью, опосредованную макрофагами в микроокружении. J Внеклеточные везикулы . 2022;11(5):e12218. дои:10.1002/jev2.12218 (IF:25.841)
[3] Мэн Ф., Ю З., Чжан Д. и др.Индуцированное фазовое разделение мутантного NF2 блокирует механизм cGAS-STING, что приводит к аннулированию противоопухолевого иммунитета. Мол Клетка . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (IF:17.970)
[ 4] Чэнь С., Лю С., Ван Дж. и др. Нацеливание DRP1, опосредованное TBK1, обеспечивает распознавание нуклеиновых кислот для перепрограммирования динамики и физиологии митохондрий. Мол Клетка . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (IF:15.584)
[5] Чжао Цюй, Чжэн К., Ма С. и др. PTPS облегчает компартментализированное S-нитрозилирование LTBP1 и стимулирует рост опухоли в условиях гипоксии. Мол Клетка . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (IF:14.548)
[6] Мо Дж., Лю Ф., Сан Х. и др. Ингибирование комплекса FACT воздействует на аберрантную сигнализацию Hedgehog и преодолевает устойчивость к сглаженным антагонистам. Рак Res . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (IF:12.701)
[7] Цзоу И., Ван А., Ши М. и др. Анализ окислительно-восстановительных ландшафтов и динамики в живых клетках и in vivo с использованием генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров. Nat Protoc . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (IF:12.423)
[8] Мао Л., Чэнь Дж., Лу Х. и др. Протеомный анализ клеток рака легких выявил решающую роль BCAT1 в метастазировании раковых клеток. Тераностика. 2021;11(19):9705-9720. Опубликовано 27 сентября 2021 г. doi:10.7150/thno.61731 (IF:11.556)
[9] Хань Л., Чжан Ф., Лю И. и др. Белок 1, ассоциированный с глобулином матки (UGRP1), связывает подопланин (PDPN), способствуя новому пути воспаления при инфекции Streptococcus pneumoniae. Клинический медицинский перевод. 2022;12(6):e850. дои: 10.1002/ctm2.850 (IF:11.492)
[10] Чжан М., Лю Ф., Чжоу П. и др. Сигнальный путь MTOR регулирует дифференцировку макрофагов из миелоидных предшественников мыши путем ингибирования аутофагии. Аутофагия . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019.1578040 (ИФ:11.059)
[11] Чжан С., Ян З., Бао В. и др. SNX10 (сортирующий нексин 10) ингибирует возникновение и прогрессирование колоректального рака, контролируя аутофагическую деградацию SRC. Аутофагия . 2020;16(4):735 -749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (ИФ:11.059)
[12] Чжан И., Дин Х., Ван Х. и др. MK2 способствует деградации Tfcp2l1 через убиквитинлигазу β-TrCP, регулируя самообновление эмбриональных стволовых клеток мыши. Представитель сотовой связи . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (IF:9.423)
[13] Цзян И., Донг И., Ло И. и др. Фосфорилирование 53BP1, опосредованное AMPK, стимулирует c-NHEJ. Представитель сотовой связи . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (IF:9.423)
[14] Сунь Ц, Йе Ю, Гуй А и др. МОРТАЛИН-Ca 2+ ось обуславливает врожденную резистентность к ритуксимабу при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. Рак Летт . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (IF:8.679)
[15] Джин Р., Чжао А., Хан С. и др. Взаимодействие S100A16 и GRP78 активирует стресс эндоплазматического ретикулума, опосредованный через путь IRE1α/XBP1 при почечном тубулоинтерстициальном фиброзе. Клеточная смерть Dis . 2021;12(10):942. Опубликовано 13 октября 2021 г. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (IF:8.469)
[16] Чжан П., Чжан З., Фу И. и др.Связанное с K63 убиквитинирование DYRK1A смягчает деградацию EGFR, опосредованную TRAF2 Sprouty 2. Клеточная смерть Dis . 2021;12(6):608. Опубликовано 11 июня 2021 г. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (IF:8.469)
[17] Чжао Т., Ли И., Шен К., Ван К., Чжан Дж. Снижение OLR1 ослабляет гликолитический метаболизм, подавляя пролиферацию клеток рака толстой кишки и химиорезистентность путем снижения регуляции SULT2B1 через c-MYC. Дис. по клеточной смерти. 2021;13(1):4. Опубликовано 17 декабря 2021 г. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (IF:8.469)
[18] Чжоу Р., У Цюй, Ван М. и др. Протеиновая фосфатаза PPM1A дефосфорилирует и активирует YAP, управляя регенерацией кишечника и печени млекопитающих. PLoS Биол . 2021; 19(2):e3001122. Опубликовано 25 февраля 2021 г. doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (IF:8.029)
[19] У С., Ван С., Линь Х., Ян С., Ба Х., Сюн Д., Сяо Л., Ли Р. Ланатозид С ингибирует репликацию вируса простого герпеса 1, регулируя распределение NRF2 внутри клеток. Фитомедицина. 2024 февр.;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (ЕСЛИ:7.9)
[20] Шен К., Сун В., Ван Х., Ван Л., Ян Й., Ху Q, Рен М., Гао З., Ван Ц., Чжэн С., Чжу М., Ян Й., Чжан Й., Вэй С., Гу Дж. Расшифровка метастатического потенциала и оптимальной послеоперационной адъювантной терапии меланомы на основе оценки метастазов. Смерть Клетки Дисков. 2023 25 окт.;9(1):397. doi: 10.1038/с41420-023-01678-6. (ЕСЛИ:7.0)
Сопутствующие товары
| Название продукта | Кот# | Спецификация |
| Ципрофлоксацина гидрохлорид | 60201ES05/25/60 | 5/25/100г |
| Ампициллин, натриевая соль | 60203ES10/60 | 10/100г |
| Доксициклин гиклат | 60204ES03/08/25 | 1/5/25г |
| Хлорамфеникол, класс USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100г |
| Канамицина сульфат | 60206ES10/60 | 10/100г |
| Тетрациклин HCl Тетрациклина гидрохлорид (USP) | 60212ES25/60 | 25/100г |
| Ванкомицина гидрохлорид | 60213ES60/80/90 | 100мг/1г/5г |
| Гентамицина сульфатная соль | 60214ES03/08/25 | 1/5/25г |
| Спектиномицина гидрохлорид | 60215ES08 | 5г |
| Флеомицин (20 мг/мл в растворе) | 60217ES20/60 | 20/5×20мг |
| Бластицидин S (Бластицидин) | 60218ES10/60 | 10/10×10мг |
| Нистатин | 60219ES08 | 5г |
| G418 Сульфат (Генетицин) | 60220ES03/08 | 1/5г |
| Пуромицин (Раствор 10 мг/мл) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 мл |
| Пуромицин дигидрохлорид | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 мг/1 г |
| Гигромицин В (50 мг/мл) | 60224ES03 | 1 г (20 мл)/10×1 г (20 мл) |
| Гигромицин В | 60225ES03/10 | 1/10г |
| Эритромицин | 60228ES08/25 | 5/25г |
| Тиментин | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2г |
| Ауреобазидин А (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1мг |
| Полимиксин В сульфат | 60242ES03/10 | 1/10МЕ |