Когда речь идет о теломерах и протеломеразе В биологии люди часто в первую очередь думают о старении, неизбежном естественном явлении. Теломеры является повторяющиеся последовательности ДНК на концах эукариотических хромосом, которые несут ответственность за поддержание целостности хромосом и регулирование цикла деления клеток.
Протеломераза это фермент синтеза ДНК обратной транскриптазы, который удлиняет теломеры. Это нуклеопротеин, состоящий из РНК и белков. Белковый компонент может катализировать синтез последовательностей повторов теломер. с компонентом РНК.
Рисунок 1. Механизм удлинения теломер, опосредованного протеломеразой[1]
Протеломераза может восстанавливать и удлинять теломеры, компенсировать дефекты репликации ДНК, предотвращать потерю теломер во время деления клеток и увеличивать количество делений клеток. В 2009 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Элизабет Х. Блэкберн, Кэрол В. Грейдер и Джеку В. Шостаку за их выдающийся вклад в раскрытие решающей роли теломер и протеломеразы в клеточной функции и старении.
Сегодня я хочу представить вам уникальную Протеломеразу: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase происходит от бактериофага N15 и является компонентом системы репликации N15, участвуя в образовании линейной профаговой ДНК. В отличие от Протеломеразы У эукариот TelN — это чисто белковый фермент без каких-либо РНК-компонентов. Он обладает расщеплением-сшиванием активность и оставляет ковалентно закрытый конец в месте расщепления после разрезания двухцепочечной ДНК (дцДНК).
Рисунок 2. Протеломераза TelN Место расщепления
TelN-протеломераза Механизм действия
Участок узнавания TelN-протеломеразы является палиндромной последовательностью длиной 56 п.н. с telR и telL с обеих сторон. Центральное положение целевой последовательности также является палиндромной последовательностью telO. TelN Протеломераза расщепляет последовательность telO и образует ковалентно закрытую шпильковую структуру на двух концах расщепления. Конец ДНК после расщепления все еще состоит из telR и telL, что известно как собачья кость ДНК (dbDNA).
Рисунок 3. Протеломераза механизм расщепления на участке TelN[2]
Благодаря особой ферментативной активности расщепления-лигирования TelN Protelomerase, кольцевая плазмидная ДНК может быть преобразована в линейные ковалентно закрытые молекулы в форме гантели посредством одношаговой ферментативной реакции. По сравнению с линейными открытыми молекулами ДНК, линейная закрытая ДНК имеет более высокий уровень экспрессии белка в клетках, что очень подходит для построения линейной закрытой концевой мини-ДНК с высокой стабильностью и минимальной чужеродной последовательностью. Плазмидная ДНК играет жизненно важную роль в качестве основного элемента мРНК-вакцины, ДНК-вакцины и клеточной генной терапии. Традиционный метод производства плазмид включает ферментацию с кишечная палочка и многоступенчатая амплификация, а также неконтролируемый риск в процессе ферментации ограничивают выход высококачественной плазмиды, что становится ключом к ограничению производственных мощностей вакцин. Компания Touchlight в Великобритании запустила инновационную технологию dbDNA. Эта технология нарушает традиционный метод бактериальной ферментации для получения плазмидной ДНК и вместо использования in vitro ферментативного синтеза ДНК. Специальная ферментативная активность расщепления-лигирования TelN Protelomerase также используется для получения линейной мини-ДНК с закрытым концом в вышеуказанном методе.
Применение протеомеразы TelN в ферментативном синтезе ДНК
Ферментативный метод ДНК in vitro на основе ДНК-полимеразы phi29 и протеломеразы TelN позволяет избежать многих неконтролируемых рисков в процессе биологической ферментации, а ферментативный метод in vitro позволяет синтезировать ДНК с высокой скоростью и высоким выходом. Синтезированная ДНК может использоваться во многих новых технологиях, таких как вакцина мРНК, вакцина ДНК, вектор генной терапии и редактирование генов.
Рисунок 4. Схема ферментативного синтеза ДНК.[3]
Процесс ферментативного синтеза ДНК
- Денатурация шаблона
Кольцевая плазмидная ДНК-матрица преобразуется в две одноцепочечные кольцевые ДНК посредством процесса денатурации.
- Усиление по принципу катящегося круга
Амплификация по типу катящегося кольца проводилась с использованием ДНК-полимеразы Phi29 и одноцепочечной кольцевой ДНК для получения длинной линейной двухцепочечной конкатемерной ДНК с интервалами последовательностей распознавания протеломеразы.
- Разрезание и ковалентное замыкание
Протеломераза TelN распознает telRL на ДНК теломерных комплексов и выполняет операции расщепления-лигирования для получения линейных, ковалентно связанных мономеров ДНК.
- Удаление бактериальной ДНК остова
Рестрикционные эндонуклеазы или экзонуклеазы разрушают ДНК скелета бактерий с открытой структурой на конце, чтобы получить ДНК, содержащую только элементы экспрессии целевого гена. Технология ферментативного синтеза ДНК обходит биологическую ферментацию и может быстро достичь синтеза плазмидной ДНК на уровне GMP, решая ограничения производственных мощностей в области генной терапии и вакцин мРНК. Она имеет огромный потенциал для индустриализации. Для содействия развитию технологии ферментативного синтеза ДНК YEASEN Biology может предоставить основные ферментные материалы для ферментативного синтеза ДНК, такие как ДНК-полимераза phi29 (14404ES) и протеломераза TelN (14540ES), для содействия исследованию и производству технологии ферментативного синтеза ДНК.
Ппрезентация выступления из YEASEN's TelN-протеломераза
- Эффективность расщепления-лигирования отличная, что эквивалентно импортным маркам.
Используя суперспиральную плазмиду, содержащую сайт распознавания протеломеры TelN в качестве шаблона, был добавлен фермент градиентного добавления (0,078-5 U) от YEASEN и бренда A. 0,5 мкг суперспиральной плазмиды было преобразовано в закрытую линейную двухцепочечную ДНК (dsDNA). Для определения эффективности преобразования использовался гель-электрофорез, и результаты показали, что активность расщепления и лигирования протеломеры TelN YEASEN была эквивалентна активности бренда A.
Рисунок 5. Обнаружение активности расщепления протеломеразой TelN M: Маркер, C: контроль суперспиральной плазмиды
- Целостность замыкания линейной двухцепочечной ДНК > 90%
Используя суперспиральную плазмиду, содержащую сайт распознавания TelN Protelomerase в качестве шаблона, добавляя TelN Protelomerase YEASEN и бренд A, преобразуя 0,5 мкг суперспиральной плазмиды в закрытую линейную dsDNA и добавляя экзонуклеазу T5 для определения ее конечной целостности через степень деградации полосы. Результаты показали, что целостность закрытия конца dsDNA, полученная с помощью TleN Protelomerase YEASEN, составила > 90%, что эквивалентно бренду A.
Рисунок 6. Тест целостности конца TelN-протеломераза. C1: плазмида, содержащая сайт распознавания TelN, без TelN-протеломераза; C2: плазмида, содержащая сайт распознавания TelN, TelN-протеломераза, без экзонуклеазы T5; Плазмида: плазмида, содержащая сайт распознавания TelN.
Сопутствующие товары из Ферментативный синтез ДНК
| Классификация продукции | Название продукта | Номер по каталогу |
| Протеломераза | 14540ES | |
| ДНК-полимераза Phi29 | 14404ES | |
| Экзонуклеаза | Экзонуклеаза III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| дНТФ | 10125ES |
Рссылки
[1] Джардини М.А., Сегатто М., да Силва М.С., Нуньес В.С., Кано М.И. Теломера и протеломераза биология. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Линейная замкнутая мини-ДНК, генерируемая прокариотическим ферментом расщепления-соединения TelN, функциональна в клетках млекопитающих. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Линейная замкнутая мини-ДНК, полученная с помощью прокариотического фермента расщепления-соединения TelN, функциональна в клетках млекопитающих. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.