С быстрым развитием гликопротеомики и исследований лекарственных препаратов на основе антител модификация гликозилирования также привлекла большое внимание. Контакт между клетками и клетками, а также между клетками и патогенами в основном осуществляется посредством взаимодействия сахаров и белков, а гликозилирование определяет адгезионные свойства гликоконъюгатов. В IgG консервативное N-связанное гликозилирование в Asn297 в Fc-области также имеет решающее значение для его активности. Кроме того, некоторые антитела также имеют дополнительные N-гликаны, которые вместе с консервативным сайтом в Asn297 в Fc-области влияют на распознавание, период полураспада и иммунный ответ антитела.
Гликозилирование белков — это сложная посттрансляционная модификация, которая включает соединение гликановых цепей в определенных участках белков. В зависимости от типа гликановой цепи гликопротеины делятся на N-связанные гликопротеины, O-связанные гликопротеины и т. д.; кроме того, на гликозилирование белков также влияют тип клетки-хозяина и условия ферментации (такие как культуральная среда, значение pH, температура и т. д.). Поэтому гликопротеины обычно имеют гетерогенность в паттернах гликозилирования, включая сайты гликозилирования, уровни гликозилирования и специфическую структуру гликановых цепей, что делает анализ гликановых цепей и работу по структурной характеристике чрезвычайно сложной. Чтобы получить максимальное количество структурной информации о гликановых цепях, основная стратегия анализа гликановых цепей заключается в том, чтобы сначала высвободить гликановые цепи из белков, а затем провести подробный анализ и характеристику. В этой стратегии решающее значение имеет эффективный, точный и стабильный метод дегликозилирования.
В настоящее время для дегликозилирования широко используются ферментативные методы.
Гликопротеины можно классифицировать на N-связанные и O-связанные гликопептиды на основе их типов гликановых цепей. Для N-связанных гликопептидов обычно используются такие ферменты, как пептид N-гликозидаза F (PNGase F), эндогликозидаза H (Endo H) и эндогликозидаза S (Endo S). PNGase F гидролизует связь GlcNAc-Asn и может удалять высокоманнозные, сложные и гибридные гликановые цепи. Endo H расщепляет гликозидные связи в пентасахаридном ядре N-гликановой цепи. Endo S специфически расщепляет N-связанные гликаны из хитобиозного ядра тяжелой цепи нативного IgG.
Рисунок 1. Участок разрезания PNGase F, Endo H и Endo S.
Среди них PNGase F является наиболее эффективным ферментативным методом удаления почти всех N-связанных Олигосахариды в гликопротеинах, которые могут расщеплять высокоманнозные, гибридные и сложные олигосахаридные гликопротеины, соединенные аспарагином, в частности, удаляя N-связанные гликаны. Место расщепления: амидная связь между самым внутренним N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) и остатком аспарагина, при этом аспарагин на белке после ферментативного гидролиза преобразуется в аспарагиновую кислоту.
Когда α1-6 фукоза расположена в ядре GlcNAc, PNGase F также может осуществлять разрез; только когда α1-3 фукоза расположена в ядре GlcNAc (обычно в гликопротеинах растений и насекомых), PNGase F не может осуществлять разрез.
Однако традиционная ферментативная реакция PNGase F требует нескольких часов для высвобождения N-гликанов антител, и из-за предпочтения высвобождения гликанов неполное дегликозилирование может привести к смещенным результатам, а полученное распределение гликанов может не отражать правильный состав терапевтических антител. Поэтому получение точного профиля N-гликанов как можно быстрее имеет решающее значение для мониторинга гликозилирования в процессе производства антител и белков слияния антител и других биотерапевтических агентов.
Быстрый PNGase F
Fast PNGase F — оптимизированный рекомбинантный реагент, который может быстро и полностью дегликозилировать антитела, иммуноглобулины, белки слияния и другие гликопротеины за несколько минут. Этот фермент может быстро и без ограничений удалять все N-гликаны и может напрямую использоваться для хроматографии или масс-спектрометрического анализа. Yeasen Fast PNGase F, N-гликозидаза F (быстрая версия) упрощает экспериментальный процесс, сокращая время эксперимента, обеспечивая при этом чувствительность и повторяемость.
Характеристики продукта:
Быстрый: Полное и быстрое дегликозилирование за несколько минут.
Высокая чистота: Отсутствие примесей протеазы и гликозидазы, чистота ≥95%.
Неселективный: Быстро и без предпочтений удалите все N-гликаны.
Хорошая совместимость: Используется непосредственно для последующего хроматографического или масс-спектрометрического анализа.
Данные испытаний:
Одностадийное дегликозилирование белка:
- 10 мкг субстрата/100 мкг антитела и ddH2O смешать до общего объема 16 мкл;
- Добавьте 4 мкл буфера Fast PNGase F (5x), конечный объем 20 мкл;
- Добавьте 1 мкл Fast PNGase F.
- Инкубируйте при температуре 50°C в течение 10 минут.
Рисунок 2. Эффект одностадийного ферментативного расщепления белкового субстрата (A) и антитела (B).
1: Маркер белка (кат. № 20350ES) 2: Конкурент + субстрат или антитело 3: Конкурент + субстрат или антитело 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Субстрат или антитело 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Конкурент
Двухэтапное дегликозилирование белка:
- 10 мкг субстрата/100 мкг антитела и ddH2O смешать до общего объема 16 мкл;
- Добавьте 4 мкл буфера Fast PNGase F (5x), конечный объем 20 мкл;
- Инкубируйте при температуре 80°C в течение 2 минут, охладите до комнатной температуры.
- Добавьте 1 мкл Fast PNGase F.
- Инкубируйте при температуре 50°C в течение 10 минут.
Рисунок 3. Эффект двухэтапного ферментативного расщепления на белковом субстрате (А) и антителе (Б).
1: Маркер белка (кат. № 20350ES) 2: Конкурент + субстрат или антитело 3: Конкурент + субстрат или антитело 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Субстрат или антитело 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Конкурент
Заключение:
- Yeasen Fast PNGase F имеет такую же или более высокую эффективность ферментативного расщепления, что и импортные конкуренты при тех же условиях реакции;
- Рекомендуется проводить двухэтапное ферментативное расщепление для обеспечения более высокой эффективности ферментативного расщепления. Некоторые антитела (например, Fab N-гликозилирование) требуют этапа предварительного нагрева
для эффективного дегликозилирования.
Кроме того, Йесен также содержит обычную PNGase F (кат. № 20407ES, удельная активность: 100000 ед./мл) и другие типы гликозидаз, такие как Endo H гликозидаза H (кат. № 20414ES), Endo S гликозидаза S (кат. № 20413ES).
Руководство по покупке
| Продукт умбер | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Название продукта | Быстрый PNGase F | PNGase F | Эндо Х | Эндо С |
| Источник | Экспрессия рекомбинантных дрожжей | Экспрессия рекомбинантных дрожжей | Экспрессия рекомбинантных дрожжей | E.coli рекомбинантная экспрессия |
| Специфическая деятельность | Непригодный | 100000 ЕД/мл | 1000000 ЕД/мл | 8000 ЕД/мг |
| Место расщепления | Почти все N-связанные гликаны | Почти все N-связанные гликаны | N-связанные высокоманнозные гликаны | Расщепляет основную дисахаридную структуру тяжелой цепи IgG |
| Время переваривания | 10 мин. | 1-3 ч. | 1-3 ч. | 1 час |
| Гликозилирование | Подходящий | Подходящий | Подходящий | Подходящий |
| Структура белка | Подходящий | Подходящий | Подходящий | Подходящий |
Информация о заказе
| Название продукта | Номер продукта | Спецификация |
| 20406ES20/50 | 20 т/50 т | |
| 20407ES01/02 | 15000 ЕД/75000 ЕД | |
| 20414ES92/97 | 10000 ЕД/50000 ЕД | |
| 20413ES80/90 | 1000 ЕД/5 x 1000 ЕД |