Значение Ct является важнейшим представлением результата в флуоресцентной количественной ПЦР. Оно используется для расчета различий в уровнях экспрессии генов или числах копий генов. Итак, какой диапазон значений Ct можно считать разумным при флуоресцентной количественной оценке? Как мы можем гарантировать, что значения Ct попадают в эффективный диапазон? Сегодня давайте позволим Сяо И ответить на этот вопрос для всех.
Что такое значение Ct?
В процессе амплификации qPCR значение Ct относится к числу циклов амплификации (порог цикла), при котором сигнал флуоресценции амплифицированного продукта достигает установленного порога флуоресценции. «C» означает цикл, а «T» означает порог. Проще говоря, значение Ct — это число циклов, которое требуется исходной матрице в qPCR для достижения определенного количества продукта, что будет более подробно объяснено далее.
Какова функция значения Ct?
1. Связь между экспоненциальной амплификацией, количеством матрицы и значением Ct
В идеальном сценарии во время qPCR гены экспоненциально амплифицируются и накапливаются в течение определенного количества циклов. Связь между количеством циклов амплификации и количеством продукта можно выразить как: количество амплифицированного продукта = начальное количество шаблона × (1 + En)^количество циклов. Однако реакции qPCR не всегда происходят в идеальных условиях. Когда количество амплифицированного продукта достигает «определенного количества продукта», количество циклов в этой точке является значением Ct, указывающим на период экспоненциальной амплификации. Связь между значением Ct и начальным количеством шаблона следующая: существует линейная связь между значением Ct шаблона и логарифмом начального количества копий этого шаблона. Более высокая концентрация начального шаблона приводит к более низкому значению Ct, тогда как более низкая концентрация начального шаблона приводит к более высокому значению Ct.
2. Кривая амплификации, порог флуоресценции и определенное количество продукта
Количество продуктов амплификации qPCR напрямую представлено в виде сигналов флуоресценции, что известно как кривая амплификации. На ранних стадиях ПЦР, когда амплификация происходит в идеальных условиях и число циклов невелико, накопление продуктов минимально, а уровень производимой флуоресценции несущественно отличается от фонового шума флуоресценции. Впоследствии производство флуоресценции входит в экспоненциальную фазу. Количество продукта ПЦР может быть обнаружено в определенной точке, когда реакция только входит в экспоненциальную фазу, которая называется «определенное количество продукта». Это может быть использовано для вывода начального содержания шаблона. Поэтому интенсивность сигнала флуоресценции, соответствующая определенному количеству продукта, известна как порог флуоресценции.
На более поздних стадиях ПЦР кривая амплификации уже не демонстрирует экспоненциальную амплификацию и входит в линейную фазу и фазу плато.
3.Воспроизводимость значений Ct
Когда циклы ПЦР достигают числа циклов, при которых возникает значение Ct, он как раз входит в фазу истинной экспоненциальной амплификации. На этом этапе незначительные ошибки еще не амплифицированы, поэтому воспроизводимость значений Ct превосходна. Это означает, что независимо от того, амплифицируется ли один и тот же шаблон в разное время или в разных пробирках в одно и то же время, полученные значения Ct остаются постоянными.
Каков диапазон значений Ct?
1.Эффективность усиления En
Эффективность ПЦР-амплификации — это эффективность, с которой полимераза преобразует целевой ген в продукты амплификации.Эффективность амплификации составляет 100%, когда одна молекула ДНК преобразуется в две молекулы ДНК. Эффективность амплификации обычно обозначается как En. Для удобства анализа в последующих статьях ниже приводится краткое введение в факторы, которые влияют на эффективность амплификации.
| Факторы влияния | Объяснение | Суждения |
| А. Ингибиторы ПЦР | 1. Матричная РНК может содержать вещества, ингибирующие реакцию ПЦР, такие как белки или детергенты и т. д. 2. Полученная после обратной транскрипции кДНК может содержать высокие концентрации матричной РНК и компонентов реагентов обратной транскрипции, которые также могут ингибировать последующую ПЦР. | 1. Наличие загрязнения можно оценить, измерив соотношения A260/A280 и A260/A230 или проведя электрофорез РНК. 2. После обратной транскрипции кДНК разбавляется в определенной пропорции. |
| B. Необоснованная конструкция праймера | Праймер не может эффективно отжигаться. | Проверьте, нет ли в праймерах димеров или шпилечных структур, а также нет ли несовпадений; иногда необходимо обращать внимание на дизайн, охватывающий интроны. |
| C.Неподходящая процедура реакции | 1. Праймеры не могут эффективно отжигаться. 2. Активность ДНК-полимеразы не полностью раскрыта. 3. При длительном воздействии высоких температур снижается активность ДНК-полимеразы. | 1. Температура отжига выше значения Tm праймера. 2. Время предварительной денатурации слишком короткое. 3. Продолжительность каждого этапа в протоколе реакции слишком велика. |
| D. Реагенты не были тщательно перемешаны или были допущены ошибки пипетирования. | В реакционной системе локальная концентрация компонентов ПЦР-реакции слишком высока или неравномерна, что приводит к неэкспоненциальной амплификации ПЦР. | / |
| E.Длина ампликона | Длина ампликона слишком велика и превышает 300 пар оснований, что приводит к низкой эффективности амплификации. | Проверьте, находится ли длина ампликона в пределах от 80 до 300 пар оснований. |
| F.Влияние реагентов ПЦР | Более низкая концентрация ДНК-полимеразы в реагентах или неоптимальная концентрация ионов в буфере приводит к тому, что фермент Taq не достигает своей максимальной активности. | Стандартная кривая используется для измерения эффективности амплификации праймеров. |
2. Диапазон значений Ct
Диапазон значений Ct составляет 15-35. Значение Ct менее 15 считается находящимся в пределах базовой фазы и не достигшим порога флуоресценции. В идеале существует линейная зависимость между значением Ct и логарифмом начального числа копий шаблона, который известен как стандартная кривая. Используя стандартную кривую, когда эффективность амплификации составляет 100%, значение Ct для количественной оценки одной копии гена рассчитывается примерно как 35. Если значение Ct больше 35, теоретически начальное число копий шаблона меньше 1, что можно считать статистически незначимым.
Для разных генов диапазон значений Ct, обусловленный различиями в исходном количестве копий гена и эффективности амплификации, требует создания стандартной кривой для этого гена, чтобы рассчитать линейный диапазон обнаружения гена.
3.Факторы, влияющие на значения Ct
Как показывает соотношение между количеством циклов амплификации и количеством продукта: Количество продукта амплификации = Начальное количество шаблона × (1 + En)^количество циклов, можно увидеть, что в идеальных условиях начальное количество шаблона и En будут влиять на значение Ct. Различия в качестве шаблона или эффективности амплификации могут привести к тому, что значение Ct будет слишком высоким или слишком низким.
4. Значения Ct слишком высокие или слишком низкие
Сяо И проконсультировался с экспертами технического отдела нашей компании и обобщил причины и решения двух распространенных типов проблем со значениями Ct, чтобы просветить наших читателей.
| Проблема | Причины | Решения |
| Значение Ct слишком высокое | Концентрация матрицы низкая или присутствуют ингибиторы ПЦР. Эффективность усиления низкая. | 1. Увеличьте концентрацию матрицы; или увеличьте степень разбавления РНК или кДНК; или подготовьте матрицу заново. 2. Снизьте температуру отжига или используйте двухэтапный метод амплификации; убедитесь, что компоненты и система тщательно перемешаны; оптимизируйте протокол реакции; или попробуйте заменить реагенты. |
| Значение Ct слишком низкое | 1. Высокая концентрация шаблона 2. Загрязнение в NTC (без контроля шаблона) и NRC (без обратного контроля) 3. Неправильная конструкция праймера | 1. Уменьшите количество РНК-матрицы или разбавьте кДНК в более высокой пропорции. 2. Замените все реагенты заново или используйте реагенты UDGase для предотвращения загрязнения. 3. Оптимизируйте процедуру, чтобы избежать неспецифической амплификации. |
На этом мы завершаем анализ причин аномального значения Ct для этой проблемы. Далее Сяо И порекомендует ряд экономически эффективных продуктов, чтобы гарантировать, что ваши экспериментальные данные будут более точными и надежными. Приходите и выбирайте свои любимые!
| Название продукта | Кот# | Размер |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 мл |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix для количественной ПЦР (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 т |
| Hifair™ AdvanceFast Одношаговый супермикс для расщепления геномной ДНК в режиме реального времени для количественной ПЦР | 11151ES60 | 100 т |
| Набор для синтеза первой цепи ДНК Hifair™ AdvanceFast (без красителя) | 11150ES60 | 100 т |