Флуоресцентная количественная ПЦР (кПЦР) — это широко используемый в лабораториях метод, который можно применять для анализа экспрессии генов, генотипирования, обнаружения патогенов, анализа SNP и многого другого. Работа кПЦР проста, а ее принцип легко понять. Теперь, когда вы сталкиваетесь с кучей запутанных данных, анализ результатов становится сложной задачей. Сегодня Сяо И расскажет вам, как упростить сложные процессы и легко получить данные, которые можно опубликовать в журналах SCI!
Распространенные методы анализа, используемые в qPCR, включают относительную количественную оценку и абсолютную количественную оценку, и выбор между этими методами должен основываться на различных экспериментальных дизайнах. В этом выпуске мы сосредоточимся на распространенном применении qPCR — анализе экспрессии генов, где обычно выбирается метод относительной количественной оценки.
Экспериментальный дизайн
Предположим, что в настоящее время нам необходимо изучить влияние световой индукции на экспрессию гена Arabidopsis AtSUC2. Контрольная группа будет состоять из растений Arabidopsis, которые не подвергались никакой обработке, в то время как экспериментальная группа будет состоять из растений, которые были обработаны определенной световой индукцией. РНК будет извлечена из обеих групп и подвергнута обратной транскрипции для получения кДНК, которая затем будет использоваться в качестве шаблона. Ген Arabidopsis GAPDH будет выбран в качестве внутреннего эталона для эксперимента qPCR.
Необходимо настроить следующие лунки для ПЦР:
1) НТК (Без контроля шаблона) используется для проверки наличия загрязнений в системе ПЦР.
2) НЗТ (Без обратной транскрипции) означает использование РНК, не прошедшей обратную транскрипцию, в качестве матрицы, которая служит контролем загрязнения геномной ДНК.
3) внутренний референтный ген используется для коррекции различий, вызванных различными начальными концентрациями образцов.
4) Выбор контрольные образцы обычно делятся на следующие категории:
- Для оценки влияния определенного метода обработки на экспрессию генов в качестве контрольного образца используется необработанный образец.
- Для выявления различий в экспрессии генов в разное время в качестве контрольного образца используется образец в момент времени 0.
- Чтобы сравнить различия в экспрессии генов в разных тканях, одна ткань произвольно выбирается в качестве контрольного образца.
Здесь следует отметить, что для каждого материала, упомянутого выше, были созданы 3 ПЦР-лунки (1, 2, 3). Это ПЦР-дубликаты, также известные как технические реплики, которые предназначены для устранения операционных ошибок и точной оценки эффективности амплификации. Кроме того, необходимо создать биологические реплики, которые включают проведение одного и того же эксперимента на разных материалах (разное время, растения, партии, реакционные планшеты) для калибровки биологической изменчивости и анализа того, имеет ли обработка статистическую значимость. В частности, в этом случае и экспериментальной, и контрольной группе требуется обрабатывать по крайней мере еще два набора образцов Arabidopsis (A, B, C). РНК извлекается из каждого набора и подвергается обратной транскрипции, после чего проводится количественная ПЦР. Для статистического анализа используется среднее значение трех биологических реплик.
Анализ результатов — метод ΔΔCt
Характерной чертой метода ΔΔCt является то, что он опирается исключительно на значения Ct для расчета, но при этом предполагается, что эффективность амплификации целевого гена и референтного гена должна быть относительно постоянной и оба должны находиться в диапазоне 90–110%.
Конкретная формула расчета выглядит следующим образом:
ΔCt = Ct (целевой ген) - Ct (референтный ген)
ΔΔCt = ΔCt (экспериментальная группа) - ΔCt (контрольная группа)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Если предположить, что вышеприведенный эксперимент посвящен изучению влияния световой индукции на экспрессию гена Arabidopsis AtSUC2, то результаты ПЦР в количественном отношении следующие:
Во время расчета мы сначала вычисляем среднее значение данных 2^-△Ct для контрольной группы (как показано на рисунке выше, которое равно 0,00116). Затем мы делим каждое значение 2^-△Ct на это среднее значение, чтобы получить значение 2^-△△Ct. Наконец, мы организуем эти значения, чтобы получить среднее значение и стандартное отклонение, что указывает на то, что уровень экспрессии целевого гена в экспериментальной группе увеличился примерно в 9,73 раза по сравнению с контрольной группой.
Результаты отображаются с помощью программного обеспечения Graphpad следующим образом:
Значение P, рассчитанное с использованием t-критерия Стьюдента программного обеспечения, составляет 0,0024, что меньше 0,05, что указывает на статистически значимую разницу и надежные результаты.
Анализ результатов — метод двойной стандартной кривой
В практических приложениях, поскольку эффективность амплификации целевого гена и референсного гена часто различается, необходимо перепроектировать праймеры и оптимизировать условия реакции для достижения той же эффективности амплификации. Однако мы также можем выбрать более удобный метод — подход с двойной стандартной кривой.
Давайте сначала разберемся с методом анализа абсолютной количественной оценки. Конкретные шаги заключаются в амплификации целевого фрагмента с помощью ПЦР, затем вставке целевого фрагмента в вектор клонирования, извлечении рекомбинантной плазмиды, и после того, как секвенирование подтвердит ее правильность, ее можно использовать в качестве стандарта. Количество плазмидной ДНК можно измерить с помощью таких инструментов, как Nanodrop, а число копий преобразуется в конкретные копии плазмиды с помощью формулы преобразования числа копий. После этого ДНК амплифицируется после серии разведений. Строится стандартная кривая с логарифмом стандартного числа копий в качестве оси x и измеренными значениями Ct в качестве оси y. На основе значения Ct неизвестного образца можно рассчитать его абсолютное число копий.
Формула расчета количества копий:
Число копий = (масса ÷ относительная молекулярная масса) × 6,02 × 10^23
Метод двойной стандартной кривой включает в себя раздельное построение стандартных образцов для целевого гена и референтного гена, выполнение абсолютной количественной оценки и создание стандартных кривых. После расчета абсолютного числа копий неизвестных образцов проводится сравнение, что обеспечивает более высокую точность.
Конкретная формула расчета выглядит следующим образом:
Q = Количество копий целевого гена / Количество копий референтного гена
RQ = Q (экспериментальный) / Q (контрольный)
В упомянутом выше эксперименте, в котором исследуется влияние световой индукции на экспрессию гена AtSUC2 Arabidopsis, были построены стандартные образцы как для AtSUC2, так и для GAPDH, а также были подготовлены следующие стандартные кривые:
Значения Ct для целевого гена и внутреннего референтного гена в образцах, подлежащих тестированию, следующие:
При расчете сначала значения Ct целевого гена и внутреннего референтного гена подставляются в линейную зависимость стандартной кривой для получения абсолютных количеств копий целевого гена и внутреннего референтного гена как в экспериментальной, так и в контрольной группах. Затем, используя формулу Q = количество копий целевого гена / количество копий референтного гена, нормализуется уровень экспрессии целевого гена.Наконец, по формуле RQ = Q(экспериментальный)/Q(контрольный) RQ рассчитывается равным 9,71, что указывает на то, что уровень экспрессии целевого гена в экспериментальной группе в 9,71 раза выше, чем в контрольной группе.
Результаты отображаются с помощью программного обеспечения GraphPad следующим образом:
Значение P, рассчитанное с использованием t-критерия Стьюдента программного обеспечения, составляет 0,0008, что меньше 0,05, что указывает на статистически значимую разницу и надежные результаты.
На этом мы завершаем анализ данных qPCR для этой сессии. Далее я порекомендую ряд экономически эффективных продуктов, которые обеспечат большую точность и надежность ваших экспериментальных данных. Приходите и забирайте их!
| Название продукта | Кот# | Размер |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 мл |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix для количественной ПЦР (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 т |
| Hifair™ AdvanceFast Одношаговый супермикс для расщепления геномной ДНК в режиме реального времени для количественной ПЦР | 11151ES60 | 100 т |
| Набор для синтеза первой цепи ДНК Hifair™ AdvanceFast (без красителя) | 11150ES60 | 100 т |