Длина зрелой miRNA составляет всего около 20nt, обычно прямой праймер покрывает всю ее длину или даже имеет избыточную часть, а обратный праймер некуда будет поместить. Текущее рыночное решение заключается в увеличении длины обратного транскрипта во время обратной транскрипции. Распространенные методы включают метод хвоста и метод стебля-петли.

1. Введение
2. Рекомендуемые продукты
3. Список сопутствующих товаров

1. Введение

МикроРНК (miRNA) — это одноцепочечные малые РНК размером около 21–23 оснований, которые образуются из одноцепочечных РНК-предшественников со шпильковой структурой из около 70–90 оснований после обработки ферментом Dicer. miRNA в основном специфически связывается с 3'-концевой некодирующей областью мРНК целевого гена и регулирует процесс трансляции посттранскрипционной мРНК целевого гена, тем самым блокируя трансляцию мРНК и способствуя деградации мРНК, что приводит к снижению экспрессии белка. Роль miRNA заключается в возникновении и развитии различных сердечно-сосудистых заболеваний, таких как онтогенез, тканевая дифференцировка, пролиферация клеток и апоптоз.

Рисунок 1. Схематическая диаграмма синтеза miRNA in vivo

Длина зрелой miRNA составляет всего около 20nt, обычно прямой праймер покрывает всю ее длину или даже имеет избыточную часть, а обратный праймер некуда будет поместить. Текущее рыночное решение заключается в увеличении длины обратного транскрипта во время обратной транскрипции. Распространенные методы включают метод хвоста и метод стебля-петли.

Рисунок 2. Синтез микроРНК методом «хвоста»

Рисунок 3. Синтез микроРНК методом «стебель-петля»

Метод tailing использует PolyA-полимеразу для добавления Poly(A)-хвоста к зрелой miRNA и использует Oligo-dT с универсальной последовательностью в качестве праймера обратной транскрипции для синтеза удлиненной miRNA, соответствующей первой цепи кДНК. Метод stem-loop использует универсальную последовательность, сложенную в структуру stem-loop, в качестве праймера для синтеза первой цепи кДНК, соответствующей удлиненной miRNA. Структура stem-loop будет открыта при подходящей температуре во время последующего процесса амплификации и в сочетании с соответствующими праймерами амплификации.

Таблица 1.Сравнение хвостовой части и стебель-петли

2. Рекомендуемые продукты

2.1 Количественная комбинация инверсии хвоста miRNA Yeasen (11148ES&11171ES)

Рисунок 4. Набор для синтеза первой цепи кДНК 11148ES-Hifair™ miRNA

Набор использует метод хвоста для обратной транскрипции первой цепи miRNA cDNA. Буфер 2×Hifair™ miRNA RT в продукте содержит все исходные материалы и праймеры для реакции хвоста miRNA и реакции обратной транскрипции и был тщательно оптимизирован. Он может гарантировать, что процессы модификации поли(A) и обратной транскрипции 3' конца miRNA выполняются эффективно и одновременно.

Рисунок 5. Универсальная основная смесь 11171ES -Hieff™ miRNA для ПЦР SYBR

Новое поколение предварительно смешанных флуоресцентных количественных ПЦР-реагентов для обнаружения, специально разработанных для количественного обнаружения miRNA, содержащих специальный пассивный референсный краситель ROX, подходит для всех инструментов qPCR, нет необходимости регулировать концентрацию ROX на разных инструментах, только в подготовительной реакции. Амплификация может быть выполнена путем добавления праймеров и матриц в систему. ДНК-полимераза использует химически модифицированную полимеразу горячего старта и взаимодействует со специальной буферной системой, что повышает специфичность и чувствительность реакции и позволяет точно количественно определять в более широком диапазоне.

2.2 Характеристики продукта

2.2.1 Совместимость со всеми платформами приборов qPCR

Рисунок 6. Совместимые результаты с различными приборами для количественной ПЦР

Используя общую РНК клеток 293T в качестве матрицы, обратную транскрипцию проводили с помощью набора Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES).Полученную кДНК разбавляли в 10 раз, а затем использовали Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) для обнаружения внутренних референтных генов hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p и U6 соответственно.

2.2.2 Высокая скорость обнаружения, до 10 пг

Рисунок 7. График амплификации

Рисунок 8. График амплификации

Используя синтетический hsa-miR-let-7e-5p(a) и общую РНК клеток 293T(b) в качестве матриц, разбавленных до следующих градиентов соответственно: 60 копий до 606 копий (6 градиентов) и 10 пг - 100 нг (5 градиентов), провели обратную транскрипцию с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК Hifair™ miRNA (кат. № 11148ES), и полученную кДНК обнаружили с помощью универсальной основной смеси для ПЦР SYBR Hieff™ miRNA (кат. № 11171ES) для экспрессии гена hsa-miR-let-7e -5p.

2.2.3 Высокая специфичность, способность различать различия в отдельных основаниях между miRNA в одном семействе

Рисунок 9. Различение различий в отдельных основаниях между miRNA

Семейство hsa-let-7 человека имеет несколько miRNA, с несколькими основаниями, которые отличаются друг от друга, или даже только одним основанием. Синтетические miRNA для каждой изоформы Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) были обратно транскрибированы в кДНК с использованием набора Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES), с использованием Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) для амплификации этих miRNA по отдельности с различными праймерами и расчета коэффициента соответствия с использованием уравнения 2-ΔCT x 100%. Результаты показывают, что близкородственные члены семейства подтипов могут быть эффективно различены.

2.2.4 Отличная эффективность усиления

Рисунок 10. Эффективность усиления

Рисунок 11. Эффективность усиления

Гены miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p были амплифицированы с использованием человеческих клеток 293T и общей РНК печени мыши в качестве матриц. Результаты показали, что по сравнению с аналогичными продуктами набор для синтеза ДНК 1-й цепи Hifair™ miRNA (кат. № 11148ES) соответствовал реакционной системе универсальной смеси qPCR SYBR Master Mix Hieff™ miRNA (кат. № 11171ES) с превосходной производительностью.

2.2.5 Отличная устойчивость

Рисунок 12. Анализ стабильности продукта при 37℃ в течение 7 дней

Рисунок 13. Анализ результатов после 50 циклов замораживания-оттаивания

Рисунок 14. Стабильные аналитические свойства количественной реакционной системы при различных температурах в течение 24 ч.

Обратная транскрипция была выполнена с помощью набора Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) с использованием общей РНК клеток 293T в качестве матрицы, и полученная кДНК была разбавлена ​​в 10 раз и обнаружена с помощью Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES). Экспрессия hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0,5.

2.3 Количественная комбинация инверсии стебля-петли miRNA Yeasen (11139ES&11170ES)

Рисунок 15. Набор для синтеза первой цепи кДНК 11139ES-Hifair™ III (gDNA digester plus)

Набор разработан на основе обратной транскриптазы Hifair™ III.Скорость синтеза фермента кДНК высокая, а термостабильность значительно улучшена. В то же время фермент усиливает сродство к шаблону и подходит для обратной транскрипции небольшого количества шаблонов и низкокопийных генов. Способность обратной транскриптазы Hifair™ III синтезировать полноразмерную кДНК также была улучшена, что позволяет синтезировать кДНК до 19,8 кб.

Рисунок 16. Универсальная основная смесь SYBR для ПЦР 11170ES-Hieff™ miRNA

Этот продукт представляет собой специальную основную смесь для количественного определения miRNA с использованием химерного флуоресцентного метода SYBR Green I. Поскольку последовательности miRNA короткие, а последовательности miRNA в одном семействе часто очень похожи, специфичность крайне необходима при количественном определении. Этот продукт основан на ДНК-полимеразе с горячим стартом и оптимизированным буфером, что может значительно снизить неспецифическую амплификацию; в то же время специальный референсный краситель ROX делает основную смесь подходящей для всех инструментов qPCR, и нет необходимости настраивать ROX на разных инструментах. Амплификацию можно выполнять путем добавления праймеров и матриц при подготовке реакционной системы.

2.3.1 Совместимость со всеми платформами приборов qPCR

Рисунок 17. Совместимые результаты с различными приборами для количественной ПЦР

Используя в качестве матрицы общую РНК клеток печени мыши, была проведена обратная транскрипция с помощью Hifair™ III 1st Strand.
Набор для синтеза кДНК (gDNA digester plus) (кат. № 11139ES), полученную кДНК разбавляли в 40 раз и использовали универсальную смесь Hieff™ miRNA qPCR SYBR Master Mix (кат. № 11170ES) для амплификации гена человека mmu-miR-125a соответственно.

2.3.2 Высокая чувствительность, до 10 пг

Рисунок 18. Определение чувствительности

Используя в качестве матрицы общую РНК клеток печени мыши, проводили обратную транскрипцию с помощью набора Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (кат. № 11139ES), и полученную кДНК последовательно разбавляли в 10 раз (диапазон 10 пг/мкл -0,1 мкг/мкл), амплифицировали гены mmu-miR-125a, mmu-miR-132 и mmu-miR-351 мышиного происхождения.

2.3.3 Высокая специфичность, способность различать различия в отдельных основаниях между miRNA в одном семействе

Рисунок 19. Различение различий в одном основании между miRNA

Семейство hsa-let-7 человека имеет несколько miRNA, с несколькими основаниями, которые отличаются друг от друга, или даже только с одним отличием основания. Эти miRNA были амплифицированы отдельно с различными праймерами с использованием Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES), и скорость совпадения была рассчитана с использованием формулы 2^-Δct x 100%.

2.3.4 Хорошая повторяемость

Рисунок 20. Обнаружение повторяемости

Используя общую РНК клеток человека 293T в качестве матрицы для обратной транскрипции, обратную транскрипцию проводили с помощью набора Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (кат. № 11139ES), полученную кДНК разбавляли в 50 раз и использовали универсальную основную смесь Hieff™ miRNA SYBR Master Mix (кат. № 11170ES) для амплификации гена человека hsa-let-7a в 90-луночном репликативном эксперименте.

2.3.5 Хорошая устойчивость

Рисунок 21.Анализ стабильности 11170ES при различных температурах в течение 14 дней

Рисунок 22. Анализ повторного замораживания и оттаивания 11170ES

Рисунок 23. Стабильные аналитические свойства количественной реакционной системы при различных температурах в течение 24 ч.

Суммарная РНК клеток печени мыши использовалась в качестве матрицы для обратной транскрипции с помощью набора Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES). Полученную кДНК разбавляли в 100 раз для амплификации мышиного гена mmu-miR-132.

3. Список сопутствующих товаров

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., основанная в 2014 году, является высокотехнологичным предприятием, занимающимся НИОКР и производством сырья для инструментальных ферментов и антигенных антител. Ее продукция включает молекулярные диагностические ферменты, белки и антитела, используемые в фармацевтике, тестировании безопасности пищевых продуктов, селекции, правосудии и других отраслях. Мы стремимся предоставлять клиентам в области наук о жизни высококачественные продукты и услуги. Сопутствующие продукты, предоставляемые Yeasen, следующие:

Таблица 2. Список сопутствующих товаров