Прямая ПЦР — это реакция, которая напрямую использует кровь, ткани животных или растений и т. д. для амплификации без этапов экстракции и очистки нуклеиновых кислот. Она обеспечивает беспрецедентное удобство амплификации ДНК, что может сэкономить много времени. Так какие же реагенты и продукты используются в прямой ПЦР?

1. Что такое прямая ПЦР?
2. Какие реагенты необходимы для прямой ПЦР
3. Сценарии применения и характеристики набора для прямой ПЦР
4. Данные о продукте
5. Отзывы клиентов
6. Информация о заказе продукции

1. Что такое прямая ПЦР?

После постоянного дополнения и усовершенствования бесчисленными учеными по всему миру технология ПЦР стала наиболее широко используемым, наиболее часто используемым и наиболее важным методом базового исследования во всей области наук о жизни. Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR и т. д., разработанные на основе широкого применения традиционной технологии ПЦР, а также новейшая цифровая ПЦР (цифровая ПЦР), значительно обогатили исследования большинства научных исследователей. Эти методы значительно ускорили развитие современных наук о жизни, особенно молекулярной биологии, и внесли большой вклад в исследование жизни и природы для всего человечества. Традиционная технология ПЦР и различные новые технологии и новые приложения, полученные из нее, имеют предварительное условие, а именно, необходимо заранее получить шаблоны нуклеиновых кислот высокой чистоты. Любой биологический образец должен пройти ряд сложных и утомительных процессов обработки образцов, чтобы получить образцы нуклеиновых кислот, которые соответствуют техническим требованиям ПЦР. Разделение и извлечение ДНК и РНК всегда были основной работой, которую соответствующий научный и технический персонал должен повторять каждый день. Из-за огромной разницы между образцами процесс разделения и извлечения ДНК и РНК также сильно отличается. Эта работа требует высокого уровня технической квалификации от операторов. Из-за использования некоторых высокотоксичных химических реагентов в традиционной технологии разделения и извлечения длительное воздействие нанесет необратимый ущерб организму оператора и даже вызовет прямой ущерб во время эксперимента. Химические реагенты, такие как фенол и хлороформ, являются важными канцерогенами в лаборатории, а жидкий азот, используемый в процессе разделения нуклеиновых кислот и извлечения растительных тканей, представляет большую угрозу безопасности операторов во время эксперимента из-за его сверхнизкой температуры. В то же время для тех, у кого есть большое количество образцов для изучения, разделение и извлечение нуклеиновых кислот является трудоемкой задачей. Сейчас наборы для выделения и извлечения нуклеиновых кислот на рынке являются зрелыми, и существует множество брендов, но все они примерно одинаковы. Будь то набор для центрифугирования с силикагелевой мембраной или набор для метода магнитных шариков, требуется много времени, а стоимость высока. Помимо стоимости набора, существуют особые требования к лабораторному оборудованию. Автоматизированная рабочая станция, используемая в методе магнитных шариков, является типичным крупномасштабным дорогостоящим оборудованием, что является огромным расходом для лаборатории. Подводя итог, можно сказать, что перед проведением экспериментов ПЦР предварительная обработка образцов является неизбежной и постоянной головной болью для исследователей. Как решить эту проблему и напрямую проводить эксперименты ПЦР без разделения и извлечения нуклеиновых кислот, всегда было проблемой, над которой размышляли многие научные исследователи и сотрудники клинических лабораторий.

Прямая ПЦР — это реакция, в которой ткани животных или растений напрямую используются для амплификации без извлечения нуклеиновой кислоты. Во многих отношениях прямая ПЦР работает так же, как и обычная ПЦР.Главное отличие заключается в пользовательском буфере, используемом в прямой ПЦР. Образец может быть напрямую подвергнут реакции ПЦР без выделения нуклеиновой кислоты, но существуют соответствующие требования к толерантности ферментов, участвующих в прямой реакции ПЦР, и совместимости буфера. Хотя в обычных образцах содержится больше или меньше ингибиторов ПЦР, прямая ПЦР все равно может достигать надежной амплификации под действием ферментов и буферов. Однако традиционная реакция ПЦР требует использования высококачественной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы для реакции. Если матрица содержит белки и другие примеси, это будет препятствовать плавному ходу реакции ПЦР.

Самая ранняя область применения прямой ПЦР — это область животных и растений, например, кровь, ткани и шерсть мышей, кошек, кур, кроликов, овец, крупного рогатого скота и других животных; листья и семена растений и т. д. Она используется для изучения генотипирования, трансгенности, обнаружения плазмид, анализа нокаута генов, идентификации источника ДНК, идентификации видов, анализа SNP и других областей. Эти области имеют некоторые общие характеристики, то есть содержание целевого гена относительно высоко, а извлечение нуклеиновой кислоты является хлопотным. Поэтому прямая ПЦР может не только сэкономить время и оказать незначительное влияние на результаты, но и сэкономить расходы.

2. Какие реагенты необходимы для прямой ПЦР

2.1 Образец лизата

Лизат образца можно приготовить самостоятельно или купить. Разница в компонентах разных марок лизата приведет к тому, что лизирующая способность будет разной, и тогда время лизирования будет немного отличаться. Например, для подготовки образцов тканей животных обычно рекомендуется лизировать в течение 30 минут или в течение ночи, а лизат для вирусов колеблется от 3 до 10 минут.

2.2 Мастер-микс для ПЦР

Рекомендуется использовать ДНК-полимеразу горячего старта для усиления специфической амплификации и более сильной амплифицирующей способности. В основе прямой ПЦР лежит высокоустойчивая полимераза.

2.3 Удалить или ингибировать компоненты в образцах, которые влияют на амплификацию ДНК

После обработки образца лизатом белки, липиды и другие клеточные остатки будут высвобождаться, и эти вещества будут ингибировать реакцию ПЦР. Поэтому для прямой ПЦР необходимо добавлять соответствующие удаляющие или ингибиторы, чтобы уменьшить влияние этих факторов.

3. Сценарии применения и характеристики набора для прямой ПЦР

Набор для прямой ПЦР от Yeasen позволяет напрямую амплифицировать образцы растительной, животной ткани или крови, а также другие исходные образцы без очистки нуклеиновой кислоты, что значительно упрощает экспериментальный процесс ПЦР. Генотипирование на основе ПЦР (рисунок 1) проводилось с использованием исходного образца без очистки генома (рисунок 1A) или с использованием его лизата (рисунок 1B) в качестве матрицы. По сравнению с обычным генотипированием на основе ПЦР набор для прямой ПЦР потребляет меньше образцов, прост в эксплуатации, имеет низкую стоимость эксперимента и высококачественное количественное обнаружение образцов.

Рисунок 1. Технология прямой ПЦР.

A. Прямой метод: возьмите небольшое количество образцов и добавьте их непосредственно в смесь для ПЦР для ПЦР-идентификации. B. Метод лизиса: добавьте образец в лизирующий раствор для высвобождения генома и добавьте небольшое количество супернатанта лизиса в смесь для ПЦР для ПЦР-идентификации.

3.1 Приложения

Обнаружение амплификации генов животных, генотипирование трансгенных животных, идентификация трансгенных растений, генотипирование растений и т. д.

3.2 Особенности

★   Прямой: без очистки ДНК;
★   Быстро: 10 мин для завершения подготовки шаблона, 50 мин для завершения реакции ПЦР;
★   Простота: образцы можно лизировать без сдвига или измельчения;
Смесь для ПЦР имеет форму мастер-микса, что сокращает количество этапов добавления образцов.
★   Экономия: меньший расход материала
★   Высокая производительность: реакцию лизиса можно завершить в 96-луночном планшете
★   Высокая толерантность к ингибиторам

4. Данные о продукте

4.1 Универсальный тип для нескольких животных: набор для прямой ПЦР тканей животных

4.1.1 Самый быстрый: сокращение времени операции

Рисунок 2. Набор для прямой ПЦР на животных тканях от Yeasen может сэкономить больше времени.

4.1.2 Пример: идентификация генотипа нокаутированных мышей

Рисунок 3. Результаты прямой амплификации тканей животных с помощью набора для прямой ПЦР для выявления животных с нокаутированным геном.

M: ДНК-лестница 100 п.н. Дорожки 1-8: лизат в качестве матрицы. +: 50 нг очищенной геномной ДНК в качестве матрицы. ﹣: деионизированная вода в качестве матрицы. Несколько циклов: 35 циклов. Один фрагмент (580 п.н.): нокаутированный животный гомозиготный геном. Один фрагмент (180 п.н.): дикий тип генома. Два фрагмента (580 п.н./180 п.н.): нокаутированный животный гетерозиготный геном.

4.2 Специфично для грызунов: набор для прямой ПЦР на тканях мышей

4.2.1 Быстрее: достаточное высвобождение генов

Рисунок 4. Результаты прямой амплификации набора для прямой ПЦР мышиной ткани с различным временем лизиса.

M: ДНК-лестница 100bp. +: 50 нг очищенной геномной ДНК в качестве матрицы. Несколько циклов: 35 циклов.

4.2.2 Лучше, чем общий метод щелочного лизиса

Рисунок 5. Результаты амплификации гена SOX21 в хвосте мыши, обработанном различными методами лизиса.

M: ДНК-лестница 100 п.н. Дорожки 1-2: Лизат в качестве матрицы при общем щелочном лизисе. Дорожки 3-4: Лизат в качестве матрицы при наборе для прямой ПЦР мышиной ткани. +: 50 нг очищенной геномной ДНК в качестве матрицы. -: Деионизированная вода в качестве матрицы. Несколько циклов: 35 циклов.

4.2.3 Сравнение с аналогичными продуктами

Рисунок 6. Результаты амплификации гена SOX21 в хвосте мыши, обработанном аналогичными продуктами разных марок.

M: ДНК-лестница 100 п.н. +: 50 нг очищенной геномной ДНК в качестве матрицы. Несколько циклов: 35 циклов.

4.3 Набор для прямой ПЦР растительных тканей

4.3.1 Проверка образцов растений разных типов

Рисунок 7. Результаты прямой амплификации листьев разных растений.

M: ДНК-лестница длиной 100 п.н. C: Очищенная геномная ДНК в качестве матрицы.Дорожки 1-2: Лизат листовой ткани в качестве шаблона. Несколько циклов: 30 циклов.

5. Отзывы клиентов

5.1 Генотипирование мышей

Рисунок 8. Результаты идентификации генотипа мыши с использованием набора для прямой ПЦР тканей мыши пользователями из Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 Прямая ПЦР на рисе

Рисунок 9. Амплификация генов, связанных с рисом, с использованием наборов для прямой ПЦР растительных тканей пользователями Хуачжунского сельскохозяйственного университета.

6. Информация о заказе продукции

Yeasen — биотехнологическая компания, занимающаяся исследованиями, разработкой, производством и продажей трех основных биологических реагентов: молекул, белков и клеток. Продукция, предоставляемая Yeasen, следующая.

Таблица 1. Информация о заказе продукта