С быстрым развитием биотехнологии мРНК-терапия как новый метод лечения привлекла большое внимание благодаря своей сильной программируемости и быстрой скорости ответа. В области мРНК-вакцин и генной терапии эффективный синтез высококачественной мРНК является ключевым шагом в достижении терапевтических целей. В этом процессе РНК-полимераза Т7 (РНКП Т7) играет важную роль, она может эффективно катализировать синтез мРНК in vitro.
Хотя T7 RNAP играет решающую роль в синтезе мРНК, на практике она часто производит двухцепочечную РНК (dsRNA) в качестве побочного продукта. dsRNA является одним из отличительных признаков многих вирусов, и поэтому она легко распознается внутриклеточными белками, связывающими dsRNA, вызывая врожденные иммунные ответы и воспалительные реакции. Это означает, что если формулы мРНК содержат более высокий уровень dsRNA, это может привести к ненужной активации иммунитета, что может повлиять на терапевтическую эффективность или вызвать серьезные побочные эффекты. Избыток dsRNA также может мешать нормальной функции мРНК, включая эффективность трансляции и стабильность мРНК, косвенно влияя на эффективность мРНК-терапии.
Рисунок 1: Влияние побочных продуктов дцРНК и оптимизированной реакции РНК-полимеразы Т7.
Таким образом, разработка и внедрение эффективных методов снижения генерации дцРНК является важнейшей частью разработки технологии мРНК. Исследователи разработали различные стратегии, включая использование улучшенных РНК-полимераз T7, модификационных нуклеотидов, оптимизацию буферов транскрипции IVT и процессы очистки в нисходящем направлении. Yeasen Biology использует возможности своей платформы направленной эволюции ZymeEditor для непрерывной эволюции основного ферментного сырья для синтеза мРНК in vitro — РНК-полимеразы T7. Мы разработали низкодезРНК-РНК-полимеразу T7, которая подавляет активность RDRP РНК-полимеразы T7, кардинально снижая образование дцРНК, тем самым значительно снижая содержание дцРНК.
Данные о продукте
Выход: более 9 мг/мл
Содержание дцРНК: содержание дцРНК значительно снижено, по крайней мере, в 10 раз.
Эффективность укупорки: более 99%
Низкий уровень РНК-полимеразы T7 Процесс проверки:
1) создание случайной библиотеки и высокопроизводительного метода скрининга FADS, случайной библиотеки мутаций из более чем 10^6 был проверен.
2) полурациональный дизайн и технология микропланшетов были использованы для скрининга библиотеки, насыщенной сайтами. Оба метода дали низкие мутанты РНК-полимеразы T7 dsRNA. Учитывая содержание dsRNA, при этом гарантируя, что другие показатели не будут снижены (такие как целостность/эффективность кэпирования/выход и т. д.), Было отобрано несколько мутантов, и один из них, названный CleaScrip™ T7, использовался для коммерческого применения.
Данные о продукте
В различных сценариях применения РНК-полимераза T7 с низкой дцРНК продемонстрировала весьма существенное снижение по сравнению как с WT T7, так и с конкурирующими продуктами, при этом гарантируя, что выход и целостность не снижаются.
| Длина фрагмента | T7 РНК-полимераза | Урожай(мг/мл） |
Честность(%） | Содержание дцРНК (нг дцРНК, полученной на 1 мкг РНК) |
| 4К | Т7-ВТ | 12.4 | 88.3 | 0,4273 |
| CleaScrip™ Т7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Компания А | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9К | Т7-ВТ | 9.5 | 81,9 | 2.9180 |
| CleaScrip™ Т7 | 9.0 | 82.0 | 0,0379 | |
| Компания А | 7.2 | 78.7 | 0,1805 |
С использованием концентрация кэпа 2,5 мМ, отличная эффективность кэпирования все еще может быть достигнута для различных длин фрагментов по сравнению с WT. Кроме того, превосходная производительность экспрессии белка также наблюдается на клеточном уровне.
| Аналоговый вход Cap（мм） | Эффективность укупорки（%）4К | |
| ВТ | Низкий уровень дцРНК | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Патент был подан в США.
Информация о продукте
| Название продукта | Номер по каталогу | Спецификация | Объем |
| CleascripТМ РНК-полимераза Т7 (низкий уровень дцРНК, 250 ед./мкл) | 10628ES | 100 /2500 /25,000KU | 400 мкл/10 мл/100 мл |
| CleascripТМ T7 РНК-полимераза GMP-класса (низкое содержание дцРНК, 250 ед./мкл) | 10629ES | 100 /2500 /25,000KU | 400 мкл/10 мл/100 мл |