Рисунок 1: Процесс транскрипции РНК in vitro

Преимущества продукта

Высокая урожайность: может производить до 200 мкг за 2 часа посредством реакции транскрипции

Лучшая универсальность: подходит для транскрипции РНК длиной 20–10000 нуклеотидов

Превосходная производительность: эффективное снижение побочных продуктов транскрипции в процессе IVT

Множественные приложения: может использоваться для синтеза обычной, меченой и модифицированной РНК

Свойства продукта

Рисунок 2: Выход транскриптов разной длины

Рисунок 3: Качество транскриптов разной длины

Рисунок 4: Выражение транскрибированный мРНК в ХЕК-293 клетки

Примечание: мРНК была защищена ферментом Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615).

Экспериментальные методы

Реагенты для размораживания

Центрифугируйте смесь РНК-полимеразы Т7 в течение короткого времени и поместите это на льду. Разморозить 10×транскрипционный буфер и рибонуклеотидс (АТФ, ЦТФ, ГТФ, УТФ), смешайте и центрифугируйте на дне пробирки, поместите 10×транскрипционный буфер при комнатной температуре и поместите 4 типа рибонуклеотидов на лед.

Б.Реакция сборки транскрипции при комнатной температуре

Подготовьте реакционную систему по следующей системе:

Компоненты	Объем (мкл)	Конечная концентрация
Свободный от РНКазы H2О	До 20	-
10×Транскрипционный буфер	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (по 100 мМ каждый)	2 каждого	10 мМ каждый
ДНК-матрица	1 мкг	-
Смесь РНК-полимеразы Т7	2	-

Примечания:

1. Реакция настраивается при комнатной температуре. Поскольку 10× буфер транскрипции содержит спермидин, высокая концентрация спермидина может вызвать осаждение ДНК-матрицы при низкой температуре.
   Для коротких транскриптов (<100 нуклеотидов) можно использовать матрицу 2 мкг, время транскрипции увеличивается до 4–8 часов.
   3. Для длинных транскриптов (>1000 нуклеотидов) рекомендуется использовать линеаризованные плазмиды в качестве матриц для транскрипции.
   4. Проводите реакцию в приборе ПЦР с открытой горячей крышкой, чтобы предотвратить испарение.
   5. Продукт реакции может иметь белый осадок. Осадок представляет собой пирофосфат магния, полученный в результате свободные пирофосфат и ионы магния в реакционном растворе, которые не влияют на последующие эксперименты. Если вы хотите удалить их, вы можете добавить немного ЭДТА. Если добавление ЭДТА влияет на последующие эксперименты, супернатант также можно получить центрифугированием.
   6. Не допускайте загрязнения реагентов и контейнеров РНКазой.

C. Инкубировать при температуре 37°C в течение 2 часов.

Смешать раствор компонентов, кратковременно центрифугировать на дне пробирки и инкубировать при 37°C в течение 2 ч. Если длина транскрипта менее 100 нт, увеличьте время реакции до 4–8 ч.

D. Обработка ДНКазой I (необязательно)

После завершения реакции добавьте в каждую пробирку по 2 мкл ДНКазы I (без РНКазы) и инкубируйте при температуре 37°C в течение 15 минут для удаления шаблонной ДНК.

Часто задаваемые вопросы

1. Низкий выход транскрипта

Качество шаблона тесно связано с урожайностью. Урожайность экспериментальной группы значительно ниже, чем контрольной. Возможные причины:

• Экспериментальный шаблон содержит ингибирующие компоненты;
• Возможно, в шаблоне что-то не так.

Предложения: ① Повторно очистить шаблон; ② Определить количественное содержание шаблона и его целостность; ③ Увеличить время реакции; ④ Увеличить количество вводимого шаблона; ⑤ Использовать другие промоторы и другие РНК-полимеразы.

2. Низкий выход коротких транскриптов

Короткие фрагменты шаблона могут ингибировать реакцию. Если продукт транскрипции составляет менее 100 нт, если вы хотите увеличить выход, увеличьте время реакции до 4-8 ч или увеличьте количество шаблона до 2 мкг.

3. Длина транскрипции РНК составляет больше чем ожидалось

Если результат электрофореза показывает, что полоса продукта больше ожидаемого размера, возможными причинами могут быть: ①Плазмидная матрица может быть не полностью линеаризована; ②3'-конец смысловой цепи имеет выраженную структуру; ③РНК имеет вторичную структуру, которая не полностью денатурирована.

Предложения: ①Проверьте, полностью ли линеаризован ли шаблон, и при необходимости выполните дополнительную линеаризацию; ②Выберите подходящий фермент рестрикции, чтобы избежать выступов 3', или используйте фрагмент Кленова/ДНК-полимеразу Т4 для завершения транскрипции перед продолжением; ③Используйте денатурированный гель для обнаружения продуктов РНК.

4. Длина транскрипции РНК составляет меньше чем ожидалось

Если электрофорез показывает, что полоса продукта меньше ожидаемого размера, то возможны следующие причины: являются: ①Шаблон содержит терминирующую последовательность, похожую на терминатор РНК-полимеразы Т7; ②Содержание GC шаблон слишком высокий.

Предложения: ①Снизьте температуру реакции (например, 30°C). Иногда снижение температуры может способствовать увеличению длины транскрипции, но это может уменьшить выход. Попробуйте другие РНК-полимеразы для транскрипции; ②Если содержание GC в матрице высокое, проведите реакцию при 42℃ или добавьте SSB для увеличения выхода и длины транскрипции.

5. Электрофоретическое выделение транскрипционных продуктов

Возникновение «хвоста» во время электрофореза может быть вызвано: ① Загрязнение РНКазой во время экспериментальной операции; ②ДНК-матрица загрязнена РНКазами.

Предложения: ①Используйте наконечники пипеток и пробирки EP, не содержащие РНКазы, надевайте одноразовые латексные перчатки и маски, а все реагенты приготавливайте с использованием H₂O. ②Повторно очистите ДНК-матрицу.

Информация о заказе

Название продукта	Номер по каталогу	Сспецификация
Набор для высокоэффективного синтеза РНК T7	10623ES	50/100/500 Т
T7 РНК-полимераза GMP-класса (250 ед./мкл)	10625ES	10КУ/100КУ/2500КУ/25МУ
Пирофосфатаза, неорганическая, GMP-класса (1 ед./мкл)	10620ES	10U/100U/1000U
Ингибитор мышиной РНКазы GMP-класса (40 ед./мкл)	10621ES	10КУ/20КУ/100КУ/1МУ
Фермент кэппинга мРНК вируса коровьей оспы, соответствующий требованиям GMP	10614ES	2КУ/10КУ/100КУ
мРНК Cap 2'-O-метилтрансфераза GMP-класса	10612ES	10КУ/50КУ/250КУ
Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) GMP-класса	10611ES	500/2000/10000 ЕД
Мастер-комплект для выделения мРНК Hieff NGS®	12603ES	24/96 Т