Описание
T7 High Yield RNA Synthesis Kit оптимизирует систему реакции транскрипции. Набор может эффективно синтезировать одноцепочечную РНК, используя РНК-полимеразу T7, линейную двухцепочечную ДНК с последовательностью промотора T7 в качестве шаблона, NTPs в качестве субстрата для контроля последовательности ДНК ниже промотора. Во время транскрипции к субстрату можно добавлять модифицированные нуклеотиды для получения РНК, меченой биотином или красителем.
Этот набор может синтезировать длинные транскрипты и короткие транскрипты, РНК может быть произведена в количестве 100-200 мкг с 1 мкг вводимой ДНК-матрицы. РНК, синтезированная путем транскрипции, может быть использована для различных последующих приложений, таких как исследование структуры и функции РНК, защита РНКазы, гибридизация зондов, РНК-интерференция, микроинъекция и in vitro перевод.
Рисунок 1: In vitro Процесс транскрипции РНК
Особенность
- До 180 мкг РНК на реакцию из 1 мкг контрольной матрицы
- Оптимизированная система реакции для процесса IVT
- Уменьшить выработку дцРНК
- Более высокая целостность и чистота РНК
Приложение
- В пробирке синтез РНК
Компоненты
| Номер компонента | Имя | 10623ES50 (50 т) | 10623ES60 (100 т) | 10623ES70 (500 т) |
| 10623-А | Смесь РНК-полимеразы Т7 | 100 мкл | 200 мкл | 1 мл |
| 10623-Б | 10×Транскрипционный буфер | 100 мкл | 200 мкл | 1 мл |
| 10623-С | АТФ (100 мМ) | 100 мкл | 200 мкл | 1 мл |
| 10623-Д | CTP (100 мМ) | 100 мкл | 200 мкл | 1 мл |
| 10623-Е | ГТФ (100 мМ) | 100 мкл | 200 мкл | 1 мл |
| 10623-Ф | UTP (100 мМ) | 100 мкл | 200 мкл | 1 мл |
| 10623-Г | Контрольная ДНК-матрица (500 нг/мкл) | 10 мкл | 20 мкл | 100 мкл |
Доставка и хранение
Транспортировка сухим льдом. Хранить при температуре -15℃ ~ -25℃, срок годности два года.
Цифры
Рисунок 1. Стандартная РНК была синтезирована in vitro с использованием набора для синтеза РНК T7.
Реакция инкубировалась в ПЦР-инструменте при 37℃ в течение 2 часов, а затем очищалась магнитными шариками (Cat#12602). Результат выхода анализировался спектрофотометром NanoDrop, как показано на рисунке 1.
Рисунки 2. Демонстрация транскрипции РНК различной длины с помощью набора T7 соответственно на электрофоретограмме (рисунки 2A), диаграмме капиллярного электрофореза (рисунки 2B) и хроматограмме (рисунки 2C)
Рисунок 3. Синтез кэпированной РНК in vitro.
Реакция инкубировалась в ПЦР-приборе при 37℃ в течение 2 часов, а затем очищалась магнитными шариками (Cat#12602). Результат выхода анализировался спектрофотометром NanoDrop, как показано на рисунке 3A. Результат целостности анализировался капиллярным электрофорезом, как показано на рисунке 3B.
1. Низкий выход транскрипта
Качество шаблона тесно связано с урожайностью. Если урожайность экспериментальной группы значительно ниже, чем у контрольной группы, то возможны следующие причины:
① экспериментальный шаблон содержит ингибирующие компоненты;
② В шаблоне что-то не так.
Предложения:
① Повторно очистите шаблон;
② Определить количественную оценку шаблона и его целостность;
③ Увеличить время реакции;
④ Увеличить объем вводимых шаблонов;
⑤ Попробуйте другие промоторы и РНК-полимеразы.
2. Низкий выход коротких транскриптов
Короткий фрагмент инициации транскрипции будет ингибировать реакцию. Если продукт транскрипции составляет менее 100 нт, увеличение времени реакции до 4-8 ч или увеличение количества матрицы до 2 мкг увеличит выход РНК.
3. Длина транскрипции РНК больше ожидаемой
Если электрофорез показывает, что полоса продукта больше ожидаемого размера, то возможные причины:
①Плазмидная матрица может быть не полностью линеаризована;
②3'-конец смысловой цепи имеет выраженную структуру;
③РНК имеет вторичную структуру, которая не полностью денатурирована.
Предложения:
①Проверьте, полностью ли линеаризован шаблон, и при необходимости выполните дополнительную линеаризацию;
②Выберите подходящий фермент рестрикции, чтобы избежать выступающих 3'-концев, или используйте фрагмент Кленова/ДНК-полимеразу Т4 для завершения транскрипции перед продолжением;
③Используйте денатурированный гель для обнаружения продуктов РНК.
4. Длина транскрипции РНК меньше ожидаемой
Если электрофорез показывает, что полоса продукта меньше ожидаемого размера, то возможные причины:
①Шаблон содержит терминирующую последовательность, похожую на РНК-полимеразу Т7;
②Содержание GC в шаблоне высокое.
Предложения:
①Снизьте температуру реакции (например, 30°C). Иногда снижение температуры может увеличить длину транскрипции, но это уменьшит выход. Или попробуйте другие РНК-полимеразы для транскрипции;
②Если содержание ГХ в шаблоне высокое, используйте 42℃ для транскрипции или добавления SSB для увеличения выхода и длины транскрипции.
5. Электрофорез продуктов транскрипции
Во время электрофореза наблюдается явление «хвоста».
Возможные причины:
①Загрязнение РНКазой во время экспериментальной эксплуатации;
②Загрязненная РНКазой матрица ДНК.
Предложения:
①Используйте наконечники пипеток и пробирки EP, не содержащие РНКазы, надевайте одноразовые латексные перчатки и маски, а все реагенты приготавливаются с использованием H2O, не содержащей РНКазы.
②Повторно очистите шаблон ДНК.
[1] Донг З., Чжэн Н., Ху С. и др.МикроРНК-подобная РНК 8 Nosema bombycis (Nb-milR8) повышает патогенность грибка, модулируя экспрессию гена BmPEX16 у его хозяина, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Ван X, Тан С, Йе С и др. Сверхчувствительное количественное определение циркулирующей miR-195-5p с каскадом амплификации с тройным смещением нитей. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
Оплата и безопасность
Ваша платежная информация обрабатывается надежно. Мы не храним данные кредитной карты и не имеем доступа к информации вашей кредитной карты.
Расследование
Вам также может понравиться
Часто задаваемые вопросы
Продукт предназначен только для исследовательских целей и не предназначен для терапевтического или диагностического использования на людях или животных. Продукты и содержимое защищены патентами, товарными знаками и авторскими правами, принадлежащими Yeasen Biotechnology. Символы товарных знаков указывают на страну происхождения, а не обязательно на регистрацию во всех регионах.
Для некоторых приложений могут потребоваться дополнительные права интеллектуальной собственности третьих лиц.
Йесен привержен этической науке, полагая, что наши исследования должны затрагивать важнейшие вопросы, обеспечивая при этом безопасность и соблюдение этических стандартов.