Несмотря на достижение хороших результатов во время пандемии и демонстрацию большого потенциала, технология мРНК все еще имеет ряд ограничений, таких как короткое время экспрессии и ограниченная трансляция белка. Хотя эти особенности могут обеспечить определенный уровень безопасности, они становятся ограничениями для таких методов лечения, как замена белка. Это требует повторного дозирования для поддержания уровней экспрессии белка, что создает новые риски и проблемы, такие как иммуногенность и нейтрализующие антитела.
Самоусиливающаяся РНК (saRNA) может вызывать тот же иммунный ответ при дозах в сотни или даже тысячи раз меньших, чем традиционная мРНК. Более низкие дозы означают более низкие производственные затраты, а менее частые инъекции могут снизить потенциальные токсические побочные эффекты от мРНК и векторов доставки. В настоящее время несколько кандидатов saRNA вошли в клинические испытания по всему миру. Крупные компании, такие как BioNTech, активно разрабатывают технологические трубопроводы saRNA.
Хотя saRNA предлагает значительные преимущества по стоимости и безопасности, ее уникальная структура представляет новые производственные проблемы. Молекула saRNA, которая объединяет последовательность, кодирующую РНК-полимеразу, с последовательностью целевого белка, намного больше (~10kb) и сложнее (содержит больше вторичных структур), чем традиционная мРНК. Это значительно увеличивает сложность реакций транскрипции in vitro, снижая выход и чистоту продукции saRNA. Поэтому производство saRNA требует более высоких стандартов в процессах синтеза, разделения и очистки.
Аффинная хроматография, метод, используемый для разделения и очистки, имеет такие проблемы, как низкий выход и целостность целевого продукта. Объединение нескольких методов хроматографической очистки (например, добавление целлюлозной хроматографии, гидрофобной обращенно-фазовой хроматографии) является громоздким, вносит новые примеси, имеет низкие показатели извлечения и является дорогостоящим. Кроме того, система реакции IVT, используемая для крупномасштабного производства, оптимизирована из систем, подходящих для синтеза последовательностей нуклеиновых кислот размером 100 нт, что делает ее непригодной для saRNA, размер которой превышает 10 кб. Это требует оптимизации существующих систем реакции IVT. В настоящее время традиционные методы очистки мРНК не могут соответствовать промышленным требованиям к качеству сырой жидкости. Поэтому существует острая необходимость в разработке и оптимизации полного и эффективного промышленного процесса разделения и очистки для самоамплифицирующейся РНК.
Оптимизация методов промышленного производства и очистки
Для разработки промышленной системы производства самоамплифицирующейся мРНК (saRNA) необходимо сначала оптимизировать типы ионов буфера и компоненты в системе котранскрипции IVT в малых масштабах. Это также включает в себя уточнение хроматографического буфера и соотношений промывки образцов для последующих процессов очистки. Эти оптимизированные условия затем можно масштабировать до крупномасштабного производства, чтобы проверить, может ли система эффективно увеличить производительность и улучшить качество исходного продукта.
Система реакции добавления кэпа котранскрипции
В системе реакции котранскрипционного кэпирования компоненты буфера T7 включают 400 мМ HEPES, 20 мМ спермидина, 100 мМ DTT и соли Mg2+.
Буфер T7 - тип соли иона магния
Тип используемой соли ионов магния влияет на выход и целостность целевого продукта saRNA.
- Для мелкомасштабного котранскрипционного синтеза 1 мг мРНК использование Mg(OAc)2 в качестве соли Mg2+ обеспечивает наилучший выход и целостность со значениями 100,5 мкг и 62,9% соответственно.
- Напротив, использование других солей ионов магния, таких как MgCl2 и MgSO4, снижает выход примерно на 25–50 %, а целостность — примерно на 10 %, значительно снижая как выход, так и целостность.
Буфер T7 – концентрация ионов магния
Оптимальная концентрация ионов ацетата магния (30–50 мМ) повышает выход и целостность целевой саРНК, при этом наилучшие результаты достигаются при концентрации 35 мМ.
- При концентрации ионов ацетата магния 30–50 мМ выход saRNA достигает 88,5–100,5 мкг, а целостность составляет 58,6–62,9%, что показывает хорошие результаты.
- При концентрации 35 мМ выход и целостность достигают максимальных значений, достигая 100,5 мкг и 62,9% соответственно.
Буфер T7 - соль иона магния в сочетании с другими солями
Добавление других солей в буфер Т7 может значительно улучшить выход и целостность целевого продукта.
- Базовый буфер T7 включает 400 мМ HEPES, 20 мМ спермидина, 100 мМ DTT и соли Mg2+, что обеспечивает выход и целостность 100,5 мкг и 62,9% соответственно.
- Добавление второй соли, NaOAc, еще больше увеличивает выход и целостность: выход увеличивается на 20–110 мкг, а целостность улучшается примерно на 2–8%.
Буфер T7 - Концентрация комбинированных солей
Когда второй солевой компонент NaOAc (Na+) находится в концентрации 5–30 мМ, выход и целостность целевой saRNA значительно улучшаются, при этом наилучшая концентрация составляет 15 мМ.
- При концентрации Na+ 3–30 мМ выход saRNA достигает 120–210 мкг, а целостность составляет 64,4–70,2%, что показывает хорошие результаты.
- При концентрации Na+ 15 мМ выход и целостность достигают максимальных значений, достигая 210 мкг и 70,2% соответственно.
Методы одиночной очистки
При мелкомасштабном (<50 мг) производстве и очистке saRNA использование различных методов очистки может значительно снизить содержание dsRNA и остатков белка, обеспечивая высокий выход, эффективность кэпирования и целостность продукта. Эффективность методов очистки от лучшего к худшему: аффинная хроматография > осаждение хлоридом лития > ультрафильтрация, целлюлозная хроматография.
-
Аффинная хроматография
Для крупномасштабного производства мРНК предпочтительнее хроматография. Варианты включают обращенно-фазовую, ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию, каждая из которых имеет свои плюсы и минусы. Аффинная хроматография, часто используемая для захвата поли(А) мРНК, предлагает масштабируемость и платформенные решения с коэффициентом извлечения >90%.
Ключевые структурные особенности мРНК, 5' кэп и 3' поли(А) хвост, облегчают очистку. Аффинная хроматография, похожая на очистку магнитными шариками, использует dT-связанные шарики для захвата поли(А) хвоста мРНК. Высокие солевые условия экранируют отрицательные заряды, позволяя связываться через водородные связи AT, и мРНК элюируется при умеренном нейтральном pH и низкой проводимости.
Аффинная хроматография для РНК подразумевает «высокое связывание соли, низкое элюирование соли». Состав буфера, размер молекулы, температура и концентрация образца существенно влияют на процесс. Выбор оптимального типа соли и концентрации путем эксперимента имеет важное значение для эффективной очистки.
Очистка: этот метод обеспечивает наивысшую целостность продукта (80,3%), наименьшее содержание дцРНК (0,01 мкг/мг), наивысшую эффективность кэпирования (96,4%) и наименьшее количество остатков белка (1,20 мкг/мг) с выходом 136 мкг и степенью извлечения 65%, что делает его лучшим с точки зрения чистоты и качества продукта.
-
Другие методы очистки:
Осаждение хлорида лития
Принцип очистки мРНК с помощью LiCl заключается в том, что литий может уменьшать электростатическое отталкивание между молекулами при определенном значении pH, обеспечивая эффективное осаждение РНК.Затем осадок отделяют центрифугированием, растворяют для получения чистого образца РНК. Осаждение LiCl является простым, быстрым, эффективным для мРНК различных размеров и дает высокочистые продукты. Однако остаточные ионы лития могут ингибировать мРНК. Рекомендуется использовать осаждение LiCl для растворов, содержащих не менее 400 мкг/мл РНК, чтобы гарантировать эффективность очистки. Этот метод дает высокий выход (210 мкг), но целостность продукта составляет всего 70,2%, что значительно снижает качество продукта. Он не подходит для крупномасштабного производства.
Метод магнитных бусин：
Магнитные шарики — это небольшие частицы, которые направленно движутся под действием магнитного поля, обычно состоящие из ядра оксида железа и внешнего покрытия. Очистка магнитными шариками — это распространенный метод молекулярной биологии для быстрого и эффективного обогащения молекул мРНК из смесей. Различные функциональные магнитные шарики имеют различные поверхностные функциональные группы (например, гидроксильные, карбоксильные, Oligo(dT), стрептавидиновые) для очистки различных биомолекул.
Карбоксилированные магнитные шарики могут эффективно очищать нуклеиновые кислоты, при этом молекулы мРНК связываются посредством электростатических взаимодействий в кислых условиях. Корректировка условий позволяет избирательно связывать и высвобождать мРНК. Более длинные мРНК с более открытыми отрицательно заряженными фосфатными группами легче связываются с шариками. Для более коротких мРНК могут потребоваться большие объемы шариков. Олиго(dT)-связанные магнитные шарики, подобно аффинной хроматографии, используют специфическое связывание между поли(A)-хвостом мРНК и олиго(dT) шариков.
Ультрафильтрация
Этот метод обеспечивает самую низкую целостность saRNA, примерно на 8% ниже, чем при аффинной хроматографии, с самым высоким содержанием белка (4,58 мкг/мг).
Хроматография целлюлозы
Этот метод обеспечивает низкое содержание дцРНК (0,009 мкг/мг) и высокую скорость кэпирования (96,4%). Однако белковые остатки немного выше (5,30 мкг/мг), при этом скорость восстановления составляет всего 57% и выход 120 мкг, что значительно ниже показателей, достигаемых с помощью аффинной хроматографии (примерно на 10% и 16 мкг соответственно).
Процесс очистки
Компоненты хроматографического буфера - Добавление восстановителей
Добавление восстановителей в хроматографический буфер во время очистки может значительно улучшить целостность продукта, скорость извлечения и эффективность кэпирования, одновременно снижая уровни побочных продуктов дцРНК и остатков белка по сравнению с отсутствием добавления восстановителей.
- Без восстановителей:
- Выход: 136 мкг
- Процент восстановления: 65%
- Целостность: 80,3%
- дцРНК: 0,01 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: 1,20 мкг/мг
- Чистота и качество продукта хорошие.
- С восстановителями (TCPE, DTT, β-меркаптоэтанол):
- Выход увеличивается на 10-40 мкг
- Скорость восстановления увеличивается на 5-18%
- Целостность улучшается примерно на 1-5%
- Эффективность укупорки: 96,4%
- dsRNA: всего 0,005 мкг/мг
- Остаток белка: всего 0,20 мкг/мг
- Значительное улучшение чистоты и качества продукции.
Компоненты хроматографического буфера - Типы восстановителей
Различные типы восстановителей, добавленные в хроматографический буфер, могут дополнительно улучшить целостность продукта, скорость восстановления и эффективность кэпирования, одновременно уменьшая остатки dsRNA и белка. TCPE оказался наиболее эффективным восстановителем.
- С TCPE:
- Выход: 175 мкг
- Процент восстановления: 83%
- Целостность: 85,2%
- дцРНК: 0,005 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: 0,20 мкг/мг
- Превосходная чистота и качество продукта.
Компоненты хроматографического буфера - Концентрация восстановителей
Добавление восстановителей в концентрации 5-15 мМ в хроматографический буфер может значительно улучшить целостность продукта, скорость восстановления и эффективность кэпирования, одновременно снижая остатки дцРНК и белка. Оптимальная концентрация составляет 10 мМ.
- Добавление 5-15 мМ TCPE:
- Выход: 160-178 мкг
- Процент восстановления: 76-85%
- Целостность: примерно 85%
- дцРНК: 0,002-0,005 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: 0,20-0,52 мкг/мг
- Хорошая чистота и качество продукта.
- С 10 мМ TCPE:
- Выход: 178 мкг
- Процент восстановления: 85%
- Целостность: 85,4%
- дцРНК: 0,002 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: 0,20 мкг/мг
- Оптимальная чистота и качество продукта.
Коэффициент стирки
Контроль соотношения хроматографического буфера к инъекционной воде в процессе промывки (10-25):(75-90) может значительно улучшить целостность продукта, скорость восстановления и эффективность кэпирования, одновременно снижая остатки дсРНК и белка. Оптимальное соотношение составляет 15:85.
- Соотношение (10-25):(75-90):
- Выход: 150-179 мкг
- Процент восстановления: 71-85%
- Целостность: 84-90%
- дцРНК: 0,002-0,006 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: приблизительно 0,20 мкг/мг
- Хорошая чистота и качество продукта.
- С соотношением 15:85:
- Выход: 179 мкг
- Процент восстановления: 85%
- Целостность: 90,0%
- дцРНК: 0,002 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: 0,20 мкг/мг
- Оптимальная чистота и качество продукта.
Комбинированные методы очистки
Использование комбинации различных методов очистки может дополнительно снизить уровни остатков dsRNA и белка в продукте, повышая общее качество. Предпочтительный порядок методов очистки: аффинная хроматография > ультрафильтрация + аффинная хроматография > аффинная хроматография + целлюлозная хроматография > целлюлозная хроматография + ультрафильтрация. Аффинная хроматография сама по себе обеспечивает наилучшие результаты.
-
Аффинная хроматография отдельно:
- Выход: 179 мкг
- Процент восстановления: 85%
- Целостность: 90,0%
- дцРНК: 0,002 мкг/мг
- Эффективность укупорки: 96,4%
- Остаток белка: 0,20 мкг/мг
- Высочайшая чистота и качество продукта.
-
Ультрафильтрация + аффинная хроматография:
- Выход: 170 мкг (на 9 мкг меньше, чем при использовании только аффинной хроматографии)
- Степень извлечения: 81% (на 4% меньше, чем при использовании только аффинной хроматографии)
- Целостность: 88,5%
- дцРНК: 0,0015 мкг/мг
- Остаток белка: 0,18 мкг/мг
- Небольшое снижение остатков dsRNA и белка по сравнению с одной только аффинной хроматографией, но значительное снижение выхода и скорости восстановления. Этот метод более сложен, удваивает время очистки и увеличивает затраты.
-
Аффинная хроматография + Целлюлозная хроматография / Целлюлозная хроматография + Ультрафильтрация:
- dsRNA: на 0,005 мкг/мг ниже, чем при использовании отдельных методов
- Выход: на 60-100 мкг меньше
- Скорость восстановления: на 30–40 % ниже
- Увеличение количества шагов приводит к увеличению затрат на рабочую силу и материалы.
Крупномасштабное производство
При крупномасштабном производстве с использованием аффинной хроматографии, аффинной хроматографии в сочетании с целлюлозной хроматографией или ультрафильтрации в сочетании с аффинной хроматографией выход самоамплифицирующейся мРНК значительно увеличивается до 140-185 мкг, с коэффициентом извлечения 67-88%. Целостность продукта составляет 93-94%, содержание дцРНК контролируется в пределах 0,0018-0,0020 мкг/мг, эффективность кэпирования достигает 96,1-96,4%, а остатки белка удерживаются в пределах 0,04-0,05 мкг/мг. Это демонстрирует хорошую масштабируемость и эффективность для крупномасштабного производства.
Ссылка:
[8] Промышленное производство и методы очистки разделения самоамплифицирующейся сырой жидкости мРНК и ее применения [P]. Патент: CN118048418A. 2024.05.17.
Информация о заказе
Йесен разработал новую РНК-полимеразу CleaScrip™ T7, которая является первоклассным ферментом для синтеза мРНК, для этого больше не требуется обработка целлюлозой для удаления dsRNA, что экономит время и трудозатраты. Содержание dsRNA в мРНК, произведенных РНК-полимеразой CleaScript™ T7, ниже, чем в мРНК, произведенных РНК-полимеразой дикого типа T7, как до, так и после этапа удаления dsRNA с использованием обработки целлюлозой. Узнайте больше подробностей по следующим ссылкам: