Прорывное достижение от Йесена и биотехнологии Molefuture

С быстрым развитием биотехнологий мРНК-терапия как новый метод лечения привлекла большое внимание благодаря своей сильной программируемости и быстрой скорости ответа. В таких областях, как мРНК-вакцины и генная терапия, эффективный синтез высококачественной мРНК является важнейшим шагом в достижении терапевтических целей. В этом процессе РНК-полимераза Т7 играет решающую роль, поскольку она может эффективно катализировать синтез мРНК in vitro.

Проблема побочного продукта dsRNA РНК-полимеразы T7

Хотя РНК-полимераза T7 играет важную роль в синтезе мРНК, фактическая операция часто приводит к образованию двухцепочечной РНК (дцРНК) в качестве побочного продукта. Присутствие дцРНК не только снижает выход и чистоту мРНК, но и может вызывать неспецифические иммунные реакции, влияя на эффективность и безопасность. Поэтому сокращение производства дцРНК стало насущной необходимостью в отрасли. В настоящее время методы снижения dsRNA в основном включают оптимизацию условий реакции и использование вспомогательных ферментов. Хотя эти методы могут в некоторой степени снизить производство dsRNA, они часто сопровождаются такими проблемами, как сложная эксплуатация и повышенные затраты.

Зачем нам заниматься инженерией РНК-полимеразы Т7?

Более фундаментальным решением является прямая модификация РНК-полимеразы T7 для снижения продукции dsRNA. Методы направленной эволюции ферментов могут улучшить ее каталитические свойства и повысить чистоту и выход продуктов путем точного изменения аминокислотной последовательности или структуры фермента. Для РНК-полимеразы T7 целевая модификация может не только снизить продукцию dsRNA, но и повысить общую эффективность и качество синтеза мРНК.

Как поставщик сырья для синтеза мРНК in vitro, Yeasen Биотехнологии и его дочерняя компания Molefuture Биотехнология, иметь разработали новую РНК-полимеразу T7, используя платформу направленной эволюции ZymeEditor. Чтобы минимизировать образование побочных продуктов, таких как dsRNA, во время процессов транскрипции in vitro, команда по эволюции спроектировала РНК-полимеразу T7 посредством комбинации рационального дизайна и направленного скрининга.

Как генерируется дцРНК?

Согласно литературным данным, продукция побочного продукта dsRNA в основном происходит из двух источников (рисунок 1): во-первых, во время перехода РНК-полимеразы T7 из конформации инициации в конформацию элонгации на ранних стадиях транскрипции, транскрипционный тройной комплекс склонен к диссоциации [1], что приводит к высвобождению большого количества коротких цепей РНК (абортивная РНК) длиной около 20 нт в систему. Эти цепи РНК действуют как «праймеры», комплементарно спариваясь с длинными цепями РНК, и удлиняются, производя dsRNA под действием РНК-зависимой РНК-полимеразной активности РНК-полимеразы T7 (активность RDRP) [2,3]. Второй источник запускается терминальной активностью переноса рибонуклеотидов, которой обладает РНК-полимераза T7. Когда реакция транскрипции достигает конца линейной матрицы, РНК-полимераза T7 может случайным образом добавлять несколько рибонуклеотидов без зависимости от матрицы. Эти рибонуклеотиды, образующие «случайные праймеры», могут обратно складываться и комплементарно спариваться с целевой областью мРНК, расширяясь для получения дцРНК. ДцРНК, полученная путем образования петли, называется петлевой дцРНК [3,4]. Поэтому для уменьшения побочных продуктов дцРНК основное внимание при модификации РНК-полимеразы Т7 уделяется стабилизации раннего транскрипционного тройного комплекса или ослаблению терминальной транспортной активности и РНК-зависимой РНК-полимеразы (RDRP) активность РНК-полимеразы Т7.

Рисунок 1. Схематическая диаграмма энергетического барьера и принципа образования дцРНК (неопубликованные данные)

Как преодолеть энергетический барьер РНК-полимеразы Т7 конформационный переход?

С помощью структурного и свободного энергетического анализа команда, с одной стороны, обнаружила, что наряду с конформационными изменениями РНК-полимеразы T7 происходит также изменение энергии. Свободная энергия конформации удлинения значительно выше, чем у конформации инициации, что указывает на то, что процесс транскрипции должен преодолеть более высокий энергетический барьер для получения полных цепей мРНК. Высокий энергетический барьер неблагоприятен для плавного конформационного перехода. Поэтому команда использовала рациональный методы скрининга для идентификации более 20 аминокислот «горячих точек» и создания соответствующих библиотек насыщающего мутагенеза.

Как изменить терминальный перенос и активность RDRP РНК-полимеразы Т7

С другой стороны, учитывая ограниченные отчеты о функциях, сайтах и ​​структурных доменах, связанных с терминальным переносом и активностью RDRP РНК-полимеразы T7, и поскольку эти две активности, которые функционально схожи, вероятно, разделяют ключевые сайты с основной реакцией РНК-полимеразы T7 — транскрипционной активностью (т. е. активностью ДНК-зависимой полимеризации РНК, DDRP), — трудно найти аминокислоты горячих точек для направленной модификации. Поэтому команда одновременно построила несколько библиотек случайных мутаций на основе подверженной ошибкам ПЦР в сочетании с высокопроизводительной эволюционной способностью платформы ZymeEditor, что привело к разнообразию, превышающему 10^6 для каждой отдельной библиотеки.

Зондовое обнаружение идеального РНК-полимераза Т7

Чтобы сбалансировать производство РНК-полимеразы Т7 и контролировать содержание дцРНК в реакции транскрипции in vitro, команда, ссылаясь на оптимизированные шаблоны транскрипции, тщательно разработала несколько флуоресцентных зонды, нацеленные на различные области целевых продуктов мРНК. Эти зонды связывают информацию, такую ​​как выход реакции, целостность и содержание dsRNA в системе, с сигналами флуоресценции. Чем сильнее интенсивность флуоресценции системы, тем более выгодны характеристики мутанта. Теоретически этот метод скрининга может ранжировать мутанты на основе интенсивности флуоресценции различных зондов, получая мутанты РНК-полимеразы T7 с высоким выходом или сниженной абортивной РНК, а также мутанты с улучшенной целостностью или сниженной петлевой dsRNA. Когда шаблон реакции заменяется на РНК, мутанты со сниженной активностью RDRP также могут быть подвергнуты отрицательному скринингу, что улучшает селективность шаблона РНК-полимеразы T7. Кроме того, путем добавления модифицированных нуклеотидов, аналогов кэпа и повышения температуры реакции в системе капельной реакции можно проводить дальнейший скрининг для выбора мутантов РНК-полимеразы T7, которые переносят неестественные субстраты и демонстрируют улучшенную термическую стабильность.

Как лучше всего проводить скрининг РНК-полимераза Т7?

Исходя из размера библиотек, команда разработали сверхвысокопроизводительные процессы скрининга на основе сортировки капель, активированных флуоресценцией (FADS), и высокопроизводительные процессы скрининга на основе традиционных методов микропланшетов (MTPS).В ходе нескольких раундов экспериментов было проверено в общей сложности более 10^7 мутантов, что привело к появлению множества мутантов со значительно сниженным содержанием dsRNA. Среди них некоторые мутанты показали снижение dsRNA, вызванное абортивной РНК в реакции, что позволяет предположить, что конформация удлинения этих мутантов полимеразы более стабильна. Некоторые мутанты показали снижение содержания петлевой dsRNA в реакции, что указывает на ослабление активности терминального переноса или активности RDRP у этих мутантов.

Учитывая, что преимущества в производительности вышеупомянутых мутантов обусловлены разными механизмами, команда построила библиотеки перетасовки ДНК, нацеленные на них. После скрининга команда наконец-то получены мутанты с превосходными характеристиками с чрезвычайно низкой генерацией дцРНК, не влияя на выходы и целостность мРНК (рисунок 2). Однако выходы мутанта G47A+884G, обнаруженного Moderna, были затронуты^[5] (неопубликовано).

Рисунок 2. Процесс эволюции фермента и характеристика производительности мутанта

(неопубликовано)

Анализ генерации дцРНК с помощью РНК-полимераза Т7 варианты?

После количественного анализа, как показано на рисунке 3, с использованием шаблона транскрипции 9 кб в условиях котранскрипционного кэпирования, РНК-полимераза дикого типа T7 продуцировала приблизительно 2,9 нг/мкг дцРНК при использовании природных нуклеотидов, в то время как коммерческая фермент Т7 произведено около 0,18 нг/мкг дцРНК. Однако продукция дцРНК каждого варианта РНК-полимеразы Т7 построенный был менее 0,10 нг/мкг. В частности, один вариант составила всего 0,015 нг/мкг, что почти в 200 раз ниже, чем у дикого типа, и в 12 раз ниже, чем у коммерческого продукт. После повторного тестирования преимущество вариантов в снижении dsRNA постоянно наблюдалось при различных условиях реакции, что указывает на хорошую совместимость этих мутантов с системой и закладывает основу для дальнейшего снижения продукции dsRNA через реакционный буфер оптимизация. Кроме того, скрининг FADS также позволил получить несколько вариантов с улучшенной целостностью продукта и термической стабильностью, которые могут соответствовать требованиям более широкого спектра приложений транскрипции in vitro

Рисунок 3. Оценка генерации дцРНК вариантами РНК-полимеразы Т7, проведенная с использованием набора Yeasen Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit и анализа точек с антителами J2.

В настоящее время несколько партнеров уже опробовали варианты РНК-полимеразы Т7, и мы получили от них высокую оценку. Использование нового фермента упрощает процесс очистки мРНК, повышает эффективность работы и демонстрирует выдающуюся производительность в различных сценариях применения.

Эти варианты находятся в патентных заявках, и мы приветствуем обсуждения по вопросам технологического сотрудничества и лицензирования.

О компании Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology является дочерней компанией Yeasen Компания Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. специализируется на предоставлении индивидуальных решений по модификации ферментов на основе технологии эволюции ферментов.Использование ресурсов Йесена Биотехнология, Molefuture работает на шести основных технологических платформах: инновационная платформа эволюции ферментов ZymeEditor, многохостовая высокоэффективная платформа экспрессии, платформа разработки процесса ферментации, платформа разработки процесса очистки, платформа производства ультрачистых ферментов и платформа анализа и контроля качества ферментов. С помощью этих шести технологических платформ Molefuture может предложить полный набор индивидуальных решений, включая эволюцию, направленную на ферменты, разработку новых ферментов, разработку процессов ферментов и масштабируемое производство на уровне GMP для удовлетворения потребностей в применении ферментов в таких областях, как диагностика in vitro, биомедицина, синтетическая биология, медицинская эстетика, фармацевтические промежуточные продукты и т. д.

Информация о заказе

Ниже приведены типичные продукты, предлагаемые Yeasen. Доступны дополнительные размеры. Наши продукты в высокой степени оптимизированы для совместной работы, чтобы помочь обеспечить превосходную производительность и воспроизводимость. Мы также можем предоставить индивидуальные услуги. Если вас интересует продукт, который не показан, свяжитесь с нами, и мы поработаем с вами, чтобы удовлетворить ваши потребности.

По поводу чтения:

Публикация отчета о проверке набора для ИФА двухцепочечной РНК (дцРНК) с целью содействия стандартизации обнаружения дцРНК.

Ссылки:

[1] Соуза Р., Мукерджи С. РНК-полимераза T7 [J]. Прогресс в исследовании нуклеиновых кислот и молекулярной биологии, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. Структурные изменения РНК-полимеразы T7 от инициации транскрипции до элонгации [J]. Текущее мнение в структурной биологии, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Вальехо Д., Никуманзар А., Паегель Б.М. и др. Сортировка капель, активированных флуоресценцией, для направленной эволюции отдельных клеток [J]. Синтетическая биология ACS, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. 3'-концевые добавления РНК-полимеразы T7 являются самошаблонной РНК, распределительными и разнообразными по характеру — анализы РНК-Seq [J]. Исследование нуклеиновых кислот, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Дусис А., Равичандран К., Хоберт Э.М. и др. Сконструированная РНК-полимераза Т7, которая производит мРНК, свободную от иммуностимулирующих побочных продуктов [J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.