Вы ищете надежный способ обнаружения остаточной dsRNA во время транскрипции мРНК in vitro? Не ищите дальше, чем набор для ИФА двухцепочечной РНК (dsRNA). Однако, при наличии нескольких коммерческих наборов важно отметить, что данные валидации не всегда могут быть общедоступными, что приводит к непоследовательности в обнаружении dsRNA. Вот почему мы делимся нашим отчетом о валидации набора для ИФА двухцепочечной РНК (dsRNA), охватывающим специфичность, точность, правильность, чувствительность и долговечность. Этот отчет служит справочным руководством для валидации методов обнаружения остаточной dsRNA, адаптированных к конкретным экспериментальным условиям и нормативным фармакопейным стандартам. Узнайте больше о нашем отчете о валидации содействовать стандартизации обнаружения дсРНК.
Двухцепочечная РНК (дцРНК) ИФА Кэто
Фон:
Набор для ИФА двухцепочечной РНК (dsRNA) — это набор реагентов, предназначенный для обнаружения остаточной дцРНК, образующейся в процессе транскрипции мРНК in vitro. Используя экспериментальный принцип иммуноферментного анализа (ИФА) с двойным сэндвичем антител и систему амплификации биотина-стрептавидина, этот набор обеспечивает чувствительное обнаружение остаточной дцРНК в образцах.
Сводные данные содержат параметры валидации, охватывающие специфичность, точность, правильность, чувствительность и долговечность. Отчет выступает в качестве справочного руководства, призывая пользователей валидировать методы обнаружения остатков dsRNA, адаптированные к их конкретным экспериментальным условиям и соответствующие нормативным фармакопейным стандартам.
Материалы и методы:
Набор: Набор для ИФА двухцепочечной РНК (дцРНК): Cat#36717ES (YEASEN). В комплект входят четыре различных типа стандартных образцов dsRNA. Пользователи имеют возможность выбрать тип стандартного образца, который соответствует их конкретному процессу создания стандартной кривой, тем самым избегая необходимости подготовки и тестирования всех образцов.
Методы: Материалы и процедурные шаги, необходимые для эксперимента, в основном определены Yeasen Biotechnology. Набор прошел обширное тестирование и оценку, что гарантирует его соответствие установленным требованиям ICH Q2(R1) и издания 2020 года Китайской фармакопеи, часть четвертая «Руководство по валидации аналитических методов 9101».
Результаты
- Линейность стандартов дцРНК
В этом отчете разработаны стандартные кривые для всех четырех различных типов стандартов dsRNA, каждый длиной 300 п.н. Эти стандарты включают STD1, немодифицированную dsRNA; STD2, модифицированную псевдо-UTP dsRNA; STD3, модифицированную N1-Me-Pseudo-UTP dsRNA; и STD4, модифицированную 5-OMe-UTP dsRNA. Каждый тип стандарта dsRNA демонстрирует превосходную линейность разбавления с R2 > 0,99 и коэффициентом вариации (CV) измеренной концентрации менее 10%, показанными в таблицах 1 и 5.
| Название ЗППП | Тип UTP | Линейность разбавления (Р2＞0,99) | резюме |
| ЗППП1 | УТП | 0.0156-1 пг/мкл | ＜10% |
| ЗППП2 | ПУТП | 0,0156-1 пг/мкл | ＜10% |
| STD3 | N1-Me-pUTP | 0,0312-1 пг/мкл | ＜10% |
| ЗППП4 | 5-OMe-UTP | 0,0625-1 пг/мкл | ＜10% |
Таблица 1. Линейность различных стандартов дцРНК.
| STD1 конц.н. (пг/мкл) | Измеренное среднее (пг/мкл) | Восстановление | резюме |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 3.1% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 2.4% |
| 0,25 | 0,2516 | 100,7% | 3,3% |
| 0,125 | 0,1227 | 98.1% | 0,5% |
| 0,0625 | 0,0640 | 102,5% | 3,2% |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2% | 1,3% |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4% | 3,2% |
| 0 | / | / | / |
Таблица 2.Восстановление и резюме разбавленного STD1
| STD2 конц.н. (пг/мкл) | Измеренное среднее (пг/мкл) | Восстановление | резюме |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 0,7% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2514 | 100,6% | 0,9% |
| 0,125 | 0,1232 | 98,6% | 2,5% |
| 0,0625 | 0,0635 | 101,6% | 1.1% |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9% | 0,5% |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6% | 0.0% |
| 0 | / | / | / |
Таблица 3. Восстановление и CV разбавленного STD2
| STD3 конц. (пг/мкл) | Измеренное среднее (пг/мкл) | Восстановление | резюме |
| 2 | 2.0031 | 100.2% | 1.6% |
| 1 | 0,9880 | 98,8% | 2.4% |
| 0,5 | 0,5188 | 103,8% | 1,2% |
| 0,25 | 0,2383 | 95,3% | 2.2% |
| 0,125 | 0,1242 | 99,4% | 0,1% |
| 0,0625 | 0,0629 | 100,7% | 1,8% |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7% | 1,6% |
| 0 | / | / | / |
Таблица 4. Восстановление и CV разбавленного STD3
| STD4 конц. (пг/мкл) | Измеренное среднее (пг/мкл) | Восстановление | резюме |
| 4 | 4.0096 | 100.2% | 1,9% |
| 2 | 1.9940 | 99,7% | 0,7% |
| 1 | 0,9977 | 99,8% | 0,1% |
| 0,5 | 0,5108 | 102.2% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2454 | 98.2% | 5.6% |
| 0,125 | 0,1207 | 96,5% | 2.8% |
| 0,0625 | 0,0624 | 99,9% | 0,3% |
| 0 | / | / | / |
Таблица 5. Восстановление и CV разбавленного STD4
-
Специфичность
- Анализ специфичности с использованием dsRNA, ssRNA, dsDNA и ssDNA.
- Специфичность не зависела от длины дцРНК.
-
Аточность
Добавление 0,5 пг/мкл STD1 к известному образцу мРНК с содержанием дцРНК 0,36 пг/мкл проводилось в трех различных объемных соотношениях (1:1, 1:20, 1:250). Во всех случаях показатели восстановления спайков находились в диапазоне 80–120%.
Скорость восстановления спайка рассчитывается следующим образом: Спайк Восстановление Скорость=(Измеренная концентрация после пиковый×всего объем из шипастый образец−Измеренный концентрация из выборка×всего объем из образец)/(Теоретический концентрация из скачок×объем из пик)×100%
| Образцы | Соотношение объема STD1/образец | Измеренная дцРНК (пг/мкл) | Шип Восстановление Ставка |
| Образец (ТС) | / | 0,36 | / |
| ТС+0,5пг/мкл ЗППП1 | 1：1 | 0,769 | 81% |
| ТС+0,5пг/мкл ЗППП1 | 1：20 | 0,777 | 82% |
| ТС+0,5пг/мкл ЗППП1 | 1：250 | 0.803 | 82% |
Таблица 6. Скорость восстановления спайка анализ
-
Точность
- Точность внутри анализа
Эксперименты проводились на трех уровнях концентрации (высокий, средний и низкий) для каждого из четырех стандартных образцов dsRNA. В рамках одного эксперимента каждый образец концентрации прошел восемь повторных тестов. Результаты показывают, что коэффициент вариации (CV) ниже 15% что свидетельствует о хорошей точности внутри анализа.
| ЗППП1 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Повторяет | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3.11% |
| 0,125 | 8 | 0.1230 | 0,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3,18% |
| ЗППП2 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Повторяет | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0,65% |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2.46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02% |
| ЗППП3 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Повторяет | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1,58% |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | 2.17% |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64% |
| ЗППП4 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Повторяет | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27% |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12% |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.76% |
Таблица 7. Анализ внутрилабораторной точности
- Точность между анализами
Было проведено три эксперимента с использованием наборов из 3 партии. В каждом эксперименте были выбраны высокие, средние и низкие концентрации, которые были протестированы три раза для каждого из четырех стандартных образцов дцРНК с восемью повторами. Следовательно, 24 точки данных были получены в каждом уровень концентрации, который затем использовался для анализа коэффициента вариации (CV). Результаты показывают, что CV для каждой концентрации стандартов был ниже 15%.
| ЗППП1 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Независимые тесты/репликации | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2.38% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3.20% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | 1,27% |
| ЗППП2 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Независимые тесты/репликации | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1,06% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52% |
| STD3 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Независимые тесты/репликации | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2.37% |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14% |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81% |
| ЗППП4 | |||
| Теоретический конц. (пг/мкл) | Независимые тесты/репликации | Измеренное среднее значение (пг/мкл) | резюме |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1,89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0,13% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5.63% |
Таблица 8. Анализ точности между анализами
-
Чувствительность
- ЛОД
Предел обнаружения набор определяется путем добавления удвоенного стандартного отклонения к среднему значению пустых значений. Измеряя OD 24 пустых значений, вычисляя их среднее значение и стандартное отклонение, а затем применяя эти значения к подобранной кривой, соответствующий предел обнаружения получается.
|
| ОД |
| ||
| дсРНК Стандарт | Среднее значение пробела | СД из Бланк | Среднее значение пустого образца + 2SD | ЛОД |
| ЗППП1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001пг/мкл |
| ЗППП2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤0,001пг/мкл |
| ЗППП3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001пг/мкл |
| ЗППП4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤0,01пг/мкл |
Таблица 9. Анализ LOD
- LOQ
Количественный предел набор устанавливается путем разбавления самой низкой точки концентрации стандартной кривой до еще более низких уровней, обеспечивая CV < 20% при самой низкой концентрации, тем самым определяя количественный порог. LOQ выглядит следующим образом.
| дсРНК Стандарт | LOQ | Повторяет | РЕЗЮМЕ(%) | Восстановление (%) |
| ЗППП1 | 0,0156 пг/мкл | 24 | ＜10% | 80~120% |
| ЗППП2 | 0,0312 пг/мкл | 24 | ＜10% | 80~120% |
| ЗППП3 | 0,0156 пг/мкл | 24 | ＜10% | 80~120% |
| ЗППП4 | 0,125 пг/мкл | 24 | ＜10% | 80~120% |
-
Дюрабильность
- Защита от помех на материалах IVT
Этот тест направленный на оценку влияния различных ферментов, буферов и т.д., добавленных к мРНК образец для обнаружения дцРНК с помощью набора.
Добавление определенных концентраций РНК-полимеразы T7, ингибитора РНКазы, IPPA (неорганической пирофосфатазы), ДНКазы I, VCE (фермента, блокирующего вирус коровьей оспы), 2'-O-метилтрансферазы (MT), 1×IVT-буфера и 1 мМ цитрата натрия к предоставленному образцу мРНК, а затем использование STD3 как для подготовки стандартной кривой, так и для тестирования образцов, позволили оценить способность набора обнаруживать содержание дцРНК в этих образцах Образцы. Результаты показывают, что присутствие восьми различных ферментов и буферов не повлияло на точность обнаружения dsRNA. Кроме того, наблюдаемые показатели восстановления находились в диапазоне от 80% до 120%.
| Материалы ИВТ | дсРНК Измерено (пг/мкл) | Восстановление |
| Никто | 0,6057 | 100% |
| РНК-полимераза Т7 (15 мкг/мл) | 0,5411 | 89.32% |
| Ингибитор мышиной РНКазы (27,5 мкг/мл) | 0,5142 | 84.88% |
| Неорганическая пирофосфатаза (IPPA 10 мкг/мл) | 0,7132 | 117,7% |
| ДНКаза I (13,75 мкг/мл) | 0,6077 | 100.32% |
| Фермент, блокирующий вирус коровьей оспы (10 мкг/мл) | 0,6563 | 108.3% |
| 2´-О-метилтрансфераза (10 мкг/мл) | 0,5776 | 95,4% |
| 1×IVT-буфер | 0,5003 | 82,6% |
| 1мМ Цитрат натрия | 0,6251 | 103,2% |
Таблица 11. Восстановление разбавленного STD3 с добавлением материалов IVT
- Температура гюрабильность
Комплекты хранились в обоих 4°С и 37°С для обнаружения отклонений концентрации стандарта dsRNA через 7 дней. Результаты показывают, что отклонения находятся в пределах 20%.
| дсРНК Стандарт | дсРНК Измерено (пг/мкл) День 0 | Дисперсии через 7 дней при 4°C |
| ЗППП1 | 1 | 10% |
| ЗППП2 | 1 | 5% |
| STD3 | 2 | 7% |
| ЗППП4 | 4 | 11% |
| дсРНК Стандарт | дсРНК Измерено (пг/мкл) | Дисперсии через 7 дней при 37°C |
| ЗППП1 | 1 | 18% |
| ЗППП2 | 1 | 4% |
| STD3 | 2 | 5% |
| ЗППП4 | 4 | 8% |
Таблица 12. Анализ температурной стойкости
Сопутствующий продукт:
| Название продукта | Артикул | Технические характеристики |
| Набор для ИФА двухцепочечной РНК (дцРНК) | 36717ES | 48Т/96Т |
| РНК-полимераза CleaScrip™ T7 (низкая концентрация РНК, 250 ед./мкл) | 10628ES | 10/100 КУ |
| РНК-полимераза Т7 Соответствует требованиям GMP (250 ед./мкл) | 10625ES | 10/100 КУ |
Связанное чтение:
Набор для ИФА двухцепочечной РНК (дцРНК) использовался для проверки мутантов РНК-полимеразы T7 с низким содержанием дцРНК в сочетании с методом точечного блоттинга антител J2.
Ссылки:
- ICH, 2022: Аналитическая валидация метода, Q2, черновая версия.
- NMPA, 2007: Общие принципы оценки валидации аналитического метода для анализа контроля качества биологической продукции
- Комиссия по фармакопейному анализу Китая (ChPC), 2020: Китайская фармакопея, часть четвертая: Руководство по валидации методов количественного анализа биологических образцов