В последние годы препараты на основе мРНК привлекли к себе значительное внимание и стали объектом исследований. T7 РНК-полимераза известна своей простотой и способностью катализировать синтез РНК с высоким выходом и точность in vitro. Однако в процессе транскрипции T7 РНК-полимераза может производить побочные продукты, такие как абортивные короткие РНК, преждевременно терминированные РНК и 3'-удлиненные РНК, что создает благоприятные условия для образования дцРНК. Поэтому снижение продукции дцРНК стало насущной необходимостью в практических приложениях.
Недавно было проведено новаторское исследование под названием «FADS и модифицированная полурациональным дизайном РНК-полимераза T7 снизили продукцию dsRNA, с более низкой терминальной трансферазной и RDRP-активностью" была опубликована в сети группой Йесена и Molefuture Team. Исследователи успешно спроектировали РНК-полимеразу T7, чтобы значительно снизить образование побочных продуктов дцРНК во время транскрипции, снизив его до 1,8% от фермента дикого типа посредством сочетания направленной эволюции и полурационального дизайна.
Скрининг РНК-полимеразы Т7 на основе FADS
Для скрининга РНК-полимеразы T7 был выбран метод FADS (сортировка капель, активированных флуоресценцией), чтобы соответствовать требованиям высокой пропускной способности эволюции белка. Чтобы предотвратить преждевременную фрагментацию клеток, исследователи использовали чип PDMS с двумя водными фазами, где лизоцим смешивался с клетками на чипе и проявлял свою активность внутри капель Рисунок 1Исследователи создали несколько случайных мутантных библиотек с разнообразием от 105 до106После скрининга было выявлено 10 доминантных вариантов, обозначенных как Mut1–Mut10. Как показано на Рисунок 2E и Рисунок 2F, содержание дцРНК Mut1, Mut7 и Mut9 было значительно ниже, чем у дикого типа
Рисунок 1. Обзор FADS
Рисунок 2. Случайный скрининг библиотеки и оценка вариантов
Полурациональный дизайн РНК-полимеразы Т7
Исследователи провели полурациональное исследование дизайна, создали десять односайтовых насыщенных библиотек и использовали традиционный метод двойных зондов на основе микротитровальных планшетов для скрининга (Рисунок 3). Добавленный 5'-концевой зонд используется для определения выхода РНК.
Рисунок 3. Полурациональный дизайн, основанный на структуре, для снижения уровня дцРНК
После скрининга более 1000 мутантов исследователи идентифицировали шесть кандидатов: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) и Mut16 (I743L). Общий выход РНК всех шести мутантов существенно не отличался от дикого типа, что указывает на сопоставимую общую эффективность транскрипции. Ожидаемо, содержание dsRNA Mut11 и Mut14 было значительно ниже по сравнению с диким типом (Рисунок 4).
Рисунок 4. Скрининг микротитровальных планшетов и оценка вариантов
Mut17 из перетасовки ДНК дает меньше дцРНК
Для дальнейшей оптимизации РНК-полимеразы Т7 были отобраны четыре варианта с низким содержанием дцРНК, отвечающие производственным требованиям.Затем исследователи построили библиотеку перетасовки ДНК и провели скрининг с помощью микротитровальных планшетов, идентифицировали вариант, который продемонстрировал более низкую продукцию dsRNA по сравнению с его родительской T7 RNAP, названный Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Затем они проанализировали транскрипционные продукты Mut17 и его родительских вариантов (Mut14, Mut11 и Mut7). Как показано в Рисунок 5, все четыре варианта показали значительное снижение продукции dsRNA во время транскрипции по сравнению с диким типом. Примечательно, что Mut17 показал значительно более низкое содержание dsRNA всего 1,80% и всего 0,007 нг/мкг в системе растворителя скрининга.
Рисунок 5. Содержание dsRNA Mut17 и его родительских мутаций
Иммуногенность продукта IVT из мутанта значительно ниже, чем у дикого типа.
Следующий, Мы оценили иммуногенность продуктов IVT при ревматоидном артрите у мышей.W264.7 клеток. Как показано на рисунках 2А и 2В, уровни мРНК и белка IFN-β были снижены при РАW264.7 клеток, трансфицированных мРНК, продуцируемой мутантами, по сравнению с диким типом, что указывает на то, что мРНК, синтезируемая РНК-полимеразой T7 дикого типа, вызывала наиболее сильный иммунный ответ, в то время как мРНК от мутантов показала значительно сниженный ответ. В частности, мРНК IFN-β клеток, обработанных РНК Mut11, составляла всего 9,7% от обработанных клеток дикого типа, а ее белок был 12,93 пг/мл. Более того, экспрессия EGFP не показала существенных различий в количестве или качестве среди мРНК, полученных с помощью различных РНК-полимераз T7. (Рисунок 6С), отвечающие требованиям промышленного применения.
Рисунок 6. Реакция IFN-β и экспрессия EGFP в клетках млекопитающих
Активность RDRP и терминальной трансферазы мутанта значительно ниже.мыr, чем у дикого типа.
Чтобы изучить влияние мутаций на снижение dsRNA, исследователи проведены исследования in silico по всем этим мутациям. Результат предполагает четкое указание на сниженную активность RDRP в вариантах, поскольку они демонстрируют сниженную тенденцию использовать РНК в качестве шаблона. Аналогично, это могло оказать влияние на терминальную трансферазную активность T7 RNAP. Как показано на Фигура 7При различных концентрациях все 4 варианта показали менее 50% значения флуоресценции по сравнению с диким типом.
Затем был использован анализ гетерогенности 3'-конца для характеристики терминальной трансферазной активности T7 РНК-полимеразы. Сосредоточившись на доле РНК с n>0, которая отражает терминальную трансферазную активность, исследователи обнаружили, что эти РНК составляли 82,94% в диком типе, тогда как мутанты показали следующие проценты: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) и Mut17 (55,62%). (Фигура 8). Важно отметить, что эти проценты в значительной степени соответствуют содержанию дцРНК в продуктах. (Рисунок 5). Эти результаты указывают на значительное снижение терминальной трансферазной активности мутантов, что вместе со снижением активности RDRP способствует снижению dsRNA.В частности, терминальная трансферазная активность может играть более важную роль, о чем свидетельствует самое низкое накопление n>0 РНК, наблюдаемое в Mut17, который также демонстрирует самую низкую продукцию дцРНК. (Рисунок 5 и Рисунок 8).
Фигура 7. Относительная активность RDRP
Фигура 8. Гетерогенность в 3'-конце РНК-продуктов
Заключение
Это исследование предоставляет надежную методологию для идентификации мутантов с пониженным содержанием dsRNA и успешно изолирует множественные мутанты dsRNA, которые имеют пониженную активность РНК-зависимой РНК-полимеразы и терминальной трансферазы. Это существенно усиливает проверку безопасности и эффективности, неотъемлемой части мРНК-терапии, подчеркивая ее глубокие последствия для продвижения мРНК-вакцин и приложений генной терапии.
В то же время материнская компания Yeasen также выпустила продукт T7 RNAP, который значительно снижает dsRNA содержание. Несколько партнеров уже протестировали модифицированные мутанты T7 RNAP, разработанные Molefuture и продукт был высоко оценен клиентами. Наши клиенты считают, что использование нового фермента упрощает процесс очистки мРНК и значительно снижает иммуногенность ИВТ продукция демонстрирует выдающиеся характеристики в различных сценариях применения, доказывая ее широкий потенциал применения в области биофармацевтики!
Информация о заказе
Ниже приведены типичные продукты, предлагаемые Yeasen. Доступны дополнительные размеры. Наши продукты в высокой степени оптимизированы для совместной работы, чтобы помочь обеспечить превосходную производительность и воспроизводимость. Мы также можем предоставить индивидуальные услуги. Если вас интересует продукт, который не показан, свяжитесь с нами, и мы поработаем с вами, чтобы удовлетворить ваши потребности.