Секвенирование нового поколения (NGS) продемонстрировало чрезвычайно широкие перспективы применения в клинических и научных исследованиях в таких областях, как обнаружение патогенов, обнаружение мутаций в опухолях и репродуктивная генетика, благодаря своей высокой чувствительности обнаружения, сильной специфичности и способности выполнять как качественное, так и количественное обнаружение. Создание библиотеки, являющееся основным этапом NGS, напрямую влияет на качество секвенирования. На основе руководств по обзору регистрации для диагностических продуктов in vitro (IVD) необходимо предоставить данные исследований основных сырьевых материалов. Необходимо провести комплексный анализ и проверку, объединив такие факторы, как базовая информация, показатели параметров и источники поставок сырья, чтобы определить наиболее подходящий источник сырья. Традиционный процесс создания библиотеки ДНК и РНК в основном включает такие ключевые этапы, как синтез кДНК, фрагментация ДНК, лигирование адаптеров и амплификация библиотеки. Различные этапы содержат много типов ферментов сырья. Скрининг ферментов сырья удлиняет цикл исследований. На этой основе экономически эффективные и простые в использовании модульные изделия для строительства библиотек стали новым выбором для разработки продуктов IVD.
Рисунок 1. Традиционный процесс создания библиотеки ДНК (слева) и процесс создания библиотеки РНК (справа) на примере платформы Illumina
Синтез обратной транскрипции является основной частью РНК-Seq, Новый тип высокого эффективность обратной транскриптазы, которая объединяет в себе множество функций, таких как высокая чувствительность, высокая урожай кДНК и совместимость с шаблонами сложных структур являются предметом исследований. Платформа модификации ферментов ZymeEditor™ компании Yeasen позволила получить универсальный продукт обратной транскрипции с существенно улучшенной производительностью за счет направленной модификации M-MLV. Его можно использовать в различных прикладных сценариях, таких как РНК-секвенирование, секвенирование отдельных клеток, клонирование кДНК и создание библиотек.
Рисунок 2. Эффективность 13488ES, применяемого в РНК-секвенировании
Из-за ограничений, связанных с короткой длиной считывания платформы секвенирования, перед построением библиотеки ДНК необходимо случайным образом фрагментировать. На раннем этапе ферментативная фрагментация была сложной задачей из-за проблем однородности и предвзятости. Биотехнологии Йесена разработал два уникальных фермента фрагментации, Энергично действующий фермент фрагментации, функционирующий при температуре 37℃. в течение 3-30 минут и слабодействующий фермент фрагментации, который функционирует при температуре 30℃ в течение 10–40 минут. Продукты ферментативной фрагментации, основанные на случайной фрагментации, постепенно устраняют свои недостатки, Они объединены в модульные продукты для фрагментации ДНК, восстановления концов и добавления А-хвоста, которые отвечают многочисленным требованиям различных образцов и различных типов секвенирования.
Рисунок 3. Эффекты фрагментации различных ферментов фрагментации ДНК: сильнодействующий фермент фрагментации (слева) и слабодействующий фермент фрагментации (справа)
Коэффициент конверсии библиотеки является важным показателем оценки качества библиотеки. Высокий коэффициент конверсии библиотеки в некоторой степени означает большую насыщенность библиотеки и лучшую однородность данных секвенирования. Обычная ДНК-лигаза Т4 фокусируется на оптимизации высокоэффективного лигирования, но фрагменты склонны к самолигированию, что снижает скорость конверсии библиотеки и влияет на ее насыщенность и качество секвенирования. Платформа ферментной инженерии Yeasen ZymeEditor™ осуществляет направленную модификацию ДНК-лигазы Т4 для получения нового мутанта, В сочетании с тщательно оптимизированным буфером лигирования был разработан продукт модуля лигирования с высокой термостабильностью и низкой скоростью самолигирования фрагментов, что значительно повышает скорость конверсии библиотеки.
Рисунок 4. Анализ термической стабильности и остатков линкера 12996ES
Все ферменты ПЦР-амплификации необходимы в методах подготовки библиотек NGS. Большинство высокоточных ДНК-полимераз обладают 5'→3' полимеразной активностью и 3'→5' экзонуклеазной активностью. Он может синтезировать ДНК в направлении 5'→3', исправляя ошибочно включенные основания, Таким образом, он может быстро и с высокой точностью амплифицировать фрагменты ДНК. Но лишь немногие ферменты специально разработаны для NGS, Существует не так много продуктов для амплификации библиотек, которые являются эффективными, точными, специфичными и способны амплифицировать мишени разных размеров и содержания ГЦ без смещения, и в то же время имеют возможность предварительного смешивания праймеров. Компания Yeasen Biotechnology разработала высокоточную ДНК-полимеразу с уникальной конструкцией и оптимизированной предварительной смесью для ПЦР с горячим стартом. Она специально разработана для эффективной, высокоточной и малосмещенной амплификации библиотеки NGS, решая проблемы сложной амплификации библиотеки NGS.
Рисунок 5. Анализ стабильности и коэффициента ошибок усиления 12980ES
В дополнение к вышеуказанной серии модулей для строительства библиотек NGS, Мы также поставляем комплексные сырые ферментные продукты, для удовлетворения совокупных потребностей различных клиентов. Сырье для строительства библиотек NGS компании Yeasen проходит строгий заводской контроль качества, строгий контроль производительности партии и стабильности качества, поэтому вы можете строить библиотеки без беспокойства.
| Категория продукта | Название продукта | Кат.№ | Замечание |
| Эффективный синтез кДНК | Hifair™ Ультра обратная транскриптаза (200 ед./мкл) | 14604ES | Фермент обратной транскрипции |
| Hieff NGS™ Набор для синтеза ds-cDNA | 13488ES | модуль синтеза кДНК | |
| ДНК Фрагментация и восстановление концов и A-хвост | Hieff™ Смераза | 12907ES | ДНК-фрагментаза |
| Модуль фрагментации ДНК Hieff NGS™ OnePot Pro (репарация концов и dA-хвост плюс) | 12619ES | ДНК Модуль фрагментации и конечного ремонта, а также A-хвоста | |
| Ремонт и А-хвост | Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/модуль dA-Tailing | 12608ES | Модуль End-Repair & A-Tailing |
| Адаптерная лигирование | 10299ES | ДНК-лигаза Т4 | |
| Усиление библиотеки | 2× Ultima HF усилительный микс | 13344ES | Высокоточный фермент |