При высокопроизводительном секвенировании для создания обычной библиотеки требуется ПЦР-амплификация. С одной стороны, она нужна для амплификации следовых образцов ДНК и увеличения выхода библиотеки. С другой стороны, она может усиливать флуоресцентные сигналы, что упрощает секвенаторам захват и идентификацию флуоресцентных сигналов для повышения точности секвенирования. Однако ПЦР похожа на «палку о двух концах». Решая проблему малого начального объема образца и усиливая флуоресцентный сигнал, она также вносит ошибки и смещения амплификации и не может идеально представить последовательность генома «Истинное лицо». Кроме того, ПЦР-полимераза имеет определенное смещение амплификации. Некоторые регионы, особенно с высоким или низким GC, вторичной структурой и другими регионами, имеют низкую эффективность амплификации и их трудно охватить. Это также приведет к появлению большого количества неправильных InDels и большому количеству дупликаций, что приведет к пустой трате объема данных ДНК и увеличению стоимости секвенирования. Таким образом, внедрение технологии PCR-Free не только имеет преимущества PCR, но и преодолевает недостатки PCR. Она может не только принести высококачественные библиотеки с высокой чувствительностью и реализовать обнаружение следовых образцов, но также иметь высокую точность и сократить последующую нагрузку по валидации для вариантов исследований. Так что же такое библиотека PCR-Free и каковы ее преимущества?

1. Что такое библиотека PCR-Free?
2. Каковы преимущества технологии PCR-Free?
3. Отображение данных PCR-Free
4. Часто задаваемые вопросы
5. Информация о продукте
6. О чтении

1. Что такое библиотека PCR-Free?

Технология секвенирования следующего поколения является наиболее часто используемой технологией в высокопроизводительных исследованиях секвенирования в современной молекулярной биологии. Традиционное секвенирование первого поколения больше не может полностью удовлетворить потребности исследователей. Повторное секвенирование генома модельных организмов и секвенирование генома немодельных организмов требуют больших затрат. Низкая, более производительная, более быстрая технология секвенирования, таким образом, давая начало технологии секвенирования второго поколения. Основной принцип технологии секвенирования второго поколения - секвенирование путем синтеза, то есть определение последовательности ДНК путем захвата вновь синтезированной информации о концевой маркировке основания. Основной принцип технологии секвенирования второго поколения для секвенирования ДНК - сначала фрагментировать ДНК, восстановить конец фрагментированной ДНК, а затем добавить специфические адаптеры с обеих сторон, а затем использовать различные методы для создания миллионов пространственно фиксированных ПЦР. Для клональных массивов данные секвенирования получают с помощью гибридизации праймеров и ферментативных реакций удлинения для визуализации флуоресцентных меток, включенных каждой реакцией удлинения.

Секвенирование ДНК с помощью секвенирования нового поколения в основном включает два процесса: подготовку библиотеки и секвенирование на машине. Во время подготовки библиотеки случайно прерванные геномные фрагменты обычно амплифицируются с помощью стандартной ПЦР. Однако для некоторых специальных шаблонов существуют такие факторы, как сложная вторичная структура или плохая термостабильность, которые влияют на предпочтение амплификации шаблонной ПЦР, поэтому не все геномные последовательности могут быть одинаково отражены в библиотеке амплификации ПЦР. Особенно для некоторых шаблонов с высоким содержанием GC или высоким содержанием AT иногда бывает сложно использовать метод ПЦР для амплификации для построения библиотеки. Нет никакой разницы между библиотекой без ПЦР и обычной библиотекой ПЦР при секвенировании на машине, за исключением того, что ПЦР не выполняется во время процесса построения библиотеки. Библиотека без ПЦР теоретически может улучшить распределение считываний данных и генерировать более равномерное покрытие генома.Библиотека без ПЦР является дополнением к методу построения библиотеки. Поскольку она напрямую готовится в бортовой библиотеке без амплификации ПЦР, она может улучшить покрытие некоторых областей с высоким GC или высоким AT, тем самым уменьшая количество баз ошибок, вносимых ПЦР, смещением данных и повторением последовательностей.

Основными этапами создания обычной библиотеки NGS являются фрагментация генома, репарация концов, добавление адаптера, ПЦР и амплификация сигнала перед секвенированием. Так что насчет создания библиотеки без ПЦР? Как следует из названия, это процесс создания библиотеки, не требующий ПЦР. Основными этапами создания библиотеки являются фрагментация генома, модификация концов, добавление линкера и контроль качества библиотеки. Но на самом деле это можно считать только процессом без ПЦР в процессе создания библиотеки. Настоящий процесс без ПЦР должен быть процессом от создания библиотеки до секвенирования без амплификации библиотеки (например, технология секвенирования одной молекулы) или технология секвенирования без накопления ошибок амплификации ПЦР (например, DNBseq от MGI).

Рисунок 1. Блок-схема построения традиционной библиотеки и построения библиотеки без ПЦР

2. Каковы преимущества технологии PCR-Free?

В процессе рутинного построения библиотеки фермент амплификации может вносить ошибки. В процессе циклической амплификации эти ошибки будут накапливаться и усиливаться, что снизит точность репликации последовательности ДНК. Кроме того, ДНК-полимераза также имеет определенное смещение амплификации, особенно для областей с большими различиями в содержании GC или вторичных структурах, что приводит к низкой эффективности амплификации и плохой однородности покрытия; при введении неправильных InDels она также принесет большое количество дупликаций, что приведет к потере объема данных ДНК и увеличит затраты на секвенирование. Технология PCR-Free может хорошо избежать вышеупомянутых проблем, вызванных ПЦР-амплификацией при традиционном построении библиотеки. В процессе построения библиотеки и секвенирования, если есть процесс ПЦР-амплификации, он будет иметь большее влияние на однородность покрытия генома. Для шаблонов ДНК некоторые имеют сложные вторичные структуры, а некоторые имеют большие различия в термостабильности. Эти факторы повлияют на эффективность ПЦР-амплификации. Таким образом, в процессе амплификации ПЦР нельзя гарантировать, что все геномные фрагменты могут получить одинаковую эффективность амплификации, но существует очевидное смещение амплификации, такое как низкое покрытие в областях генома с высоким или низким GC. Однако во всем процессе секвенирования без ПЦР нет ПЦР. По сравнению с конструированием библиотеки ПЦР покрытие областей генома с высоким GC и областей повторов AT/TA улучшено. Конкретные преимущества заключаются в следующем.

2.1 Оптимизированный процесс подготовки библиотеки, экономящий время

Подготовка библиотеки без ПЦР устраняет необходимость в ПЦР-амплификации и других этапах, оптимизируя процесс подготовки библиотеки и экономя время.

2.2 Снижение затрат на подготовку библиотеки

В традиционном процессе подготовки библиотеки для ПЦР-амплификации используются дорогие высокоточные ферменты, чтобы гарантировать аутентичность последовательности. В то же время, PCR-Free исключает этап ПЦР-амплификации, снижая затраты на подготовку библиотеки.

2.3 Уменьшение смещения усиления

Ферменты амплификации ДНК имеют определенные смещения амплификации, особенно для шаблонов со значительными различиями в содержании GC или вторичной структуре. Поэтому PCR-Free может эффективно избегать смещения амплификации, вызванного полимеразой.

2.4 Отсутствие ПЦР-дублирования

Технология PCR-Free позволяет сократить количество повторных прочтений, повысить показатели уникального картирования и эффективность использования данных.

2.5 Уменьшение количества ошибок

ПЦР-амплификация с большей вероятностью приведет к ошибкам репликации вставок и делеций, что приведет к более высокому уровню ошибок секвенирования инделей, в то время как метод PCR-Free позволяет эффективно избегать возникновения и накопления таких ошибок.

3. Отображение данных PCR-Free

Hieff NGS™ Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit V2 (Кат. № 12196ES) имеет более высокий коэффициент конверсии библиотеки, чем конкурирующие продукты.

Рисунок 2. Количество данных секвенирования вне машины для построения библиотеки без ПЦР

4. Часто задаваемые вопросы

В: Какие типы образцов подходят для библиотек без ПЦР?

A: Для некоторых образцов со сложными вторичными структурами, высоким ГХ и предпочтением ПЦР можно выбрать библиотеку без ПЦР для построения.

В: Каков общий размер фрагмента библиотеки без ПЦР?

A: Библиотека PCR-free сама по себе не имеет особых требований к размеру фрагмента. Библиотека продуктов PCR, библиотека конструируется в соответствии с размером продукта PCR. Для геномной библиотеки рекомендуется около 350bp, чтобы качество данных библиотеки было относительно хорошим.

5. Информация о продукте

Продукция, которую может предоставить Yeasen, представлена ​​в Таблице 1.

Таблица 1. Информация о продукте

6. О чтении

Решение для подготовки библиотеки NGS из образцов ДНК

Насколько хорошо вы разбираетесь в технологиях, связанных с NGS?