Введение к органоиды
Органоиды — это трехмерные клеточные культуры, в которых стволовые клетки внедрены в матричный гель. Под воздействием химических низкомолекулярных ингибиторов/активаторов, цитокины, и средние добавки, эти культуры развиваются в органоподобные тканевые структуры.
Характеристика из органоиды
Органоиды иметь способность к самообновляться, поддерживать физиологический структура и функция исходной ткани, и известны как «микроорганы в чашке Петри». Используя самообновление, способности стволовых клеток к дифференциации и самоорганизации, Органоиды могут быть криоконсервированы для использования в качестве биобанки и расширенный на неопределенный срок. Органоиды демонстрируют высокую сложность и больше напоминают состояние in vivo по сравнению с традиционными двумерными клеточными культурами.
![Figure 1. Organoid culture of human colon adenocarcinoma cells [1]](https://cdn.shopify.com/s/files/1/0803/9419/1166/files/1_5935b867-79e5-4a23-859d-b65fcd8e4c44_1024x1024.png?v=1740728801)
Фигура 1. Органоид культура из человек толстая кишка аденокарцинома клетки [1]
Приложение из органоиды
Органоиды позволяют лучше имитировать среду in vivo, Преодолевая разрыв между моделями животных и клеточными исследованиями. Они служат мощными инструментами для исследования опухолей, проверка на наркотики, регенеративная медицина, и другие области, с применением от функциональной индукции тканей до клинических трансляционных исследований. и широко используются в различных аспектах исследований, таких как функциональная индукция тканей, моделирование болезни, проверка на наркотики, противовоспалительные тесты, клинические конечные исследования и другие исследования, и использовались в фундаментальных исследованиях и трансляционных приложениях.Он имеет большие перспективы применения в фундаментальных исследованиях и трансляционных приложениях.
С постоянным развитием Системы культивирования органоидов и экспериментальные методы. Органоидные культуры использовались для различных тканей и органов, включая кишечник (тонкий кишечник/толстая кишка), желудок, печень, сердце, легкие, простата, поджелудочная железа, почки, молочные железы, мозг, сетчатка, и внутреннее ухо.
Органоиды, полученные из опухолевых стволовых клеток, также начали демонстрировать большой потенциал в понимании механизма развития опухолей., скрининг чувствительности к препаратам, и продвижение точной медицины и персонализированной диагностики. Несколько статей из Cell and Science показали, что опухолевые органоиды обладают высокой чувствительностью и специфичностью в прогнозировании эффективности противораковых препаратов. Недавно, Было показано, что опухолевые органоиды полезны для прогнозирования реакции пациентов на противораковые препараты и помогают разрабатывать персонализированные схемы лечения.
1.Изучение механизмов развития: Способность органоидов к дифференциации может быть использована при изучении процессов эмбрионального развития и их механизмов.
Органоиды регулируют процессы, вызванные сигнальными путями, такими как Wnt и BMP, которые можно использовать для изучения развития таких органов, как мозг, поджелудочная железа и желудок.[2][3][4]
2.Моделирование повреждений, вызванных болезнью: Органоид-индуцированные специфические ткани или органы, которые можно использовать для исследований в конкретных моделях заболеваний.
Группа Бин Чжао и Синьхуа Линь применили модель инфекции органов, подобную человеческой, для изучения молекулярного механизма заражения SARS-CoV-2 (новым коронавирусом) и повреждения печени., что является важным инструментом для изучения патогенеза неокоронавируса и последующей разработки лекарственных препаратов.[5]
Исследовательская группа Дэн Хункуя в Школе биологических наук Пекинского университета сконструировала новый органоид тонкого кишечника - Hyperorganoid с характеристиками регенерации повреждений in vitro, используя малые молекулы и цитокины для стимуляции. Этот органоид обладает способностью амплифицировать и поддерживать геном при длительной трансмиграции, способствуют восстановлению повреждений тканей толстой кишки, и облегчить патологические симптомы в моделях острого колита у животных.[6]
3.Регенеративная медицина: органоиды, полученные из стволовых клеток, которые способны восстанавливать или заменять поврежденные или больные ткани для восстановления нормальной функции тканей, имеют широкий спектр применения в клеточной терапии, в том числе при других нейродегенеративных заболеваниях, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатия и травмы позвоночника.
В качестве нового терапевтического метода в области регенеративной медицины DA01 использует малые молекулы SB-431542 (кат. № 53004ES), LDN193189 (Кат. № 53012ES), ЧИР-99021
(Кат. № 53003ES), и Y-27632 (Кат. № 53006ES, Кат.№52604ES), и белок Sonic Hedgehog (Shh) (кат. № 92566ES, Кат.№92589ES), для стимуляции дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в дофаминергические нейроны и трансплантации в поврежденные области мозга пациентов с прогрессирующей болезнью Паркинсона, предоставить новые направления и идеи для лечения заболевания.[7]
4.Тестирование токсичности и эффективности лекарственных препаратов: использование органоидов для проверки фармакокинетической токсичности новых лекарственных средств в определенных органах или тканях, предоставление информационной поддержки для разработки новых лекарственных препаратов.
Нефротоксичность цисплатина (цисплатина) была проверена с использованием почечного органоида Хаймана.[8]
5.Проверка на наркотики: Органоиды, полученные из стволовых клеток, можно использовать для in vitro тестирования реакции на лекарственные препараты, предоставление теоретической поддержки для скрининга наркотиков
Органы толстой кишки можно использовать для изучения режимов дозирования у пациентов с мутациями CFTR, и опухолевые органы могут быть использованы для оценки индивидуальной дозировки у пациентов.[9]
Эволюция органоидов
Источники органоидов
Нормальные органоиды в основном происходят из стволовых клеток., которые включают плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) и взрослые стволовые клетки (ВСК), из которых плюрипотентные стволовые клетки включают эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). По сравнению с плюрипотентными стволовыми клетками, Преимущество взрослых стволовых клеток в простоте и быстроте моделирования, но недостаток в том, что построенные органоидные структуры относительно просты. Органоидные структуры, построенные плюрипотентными стволовыми клетками, более сложны.
Культура органоидов
| Органойг Тип | Необходимый Сторговый центр Молекула | Необходимый Гроут Фактеры | СМИ и Добавки |
| Тонкий кишечник | Y-27632, СБ-202190, А 83-01, Гастрин, Никотинамид | ЭФР, Ноггин, Р-Спондин 1, Wnt-3a | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин, Н-2 |
| Гастрический | Y-27632, СБ-202190, А 83-01, Гастрин я, Никотинамид | ФГФ-10, ЭФР, Ноггин, Р-Спондин 1, Wnt-3а | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин- стрептомицин |
| Лболезнь печени | Y-27632, А 83-01, ДАПТ, Форсколин, Гастрин, Никотинамид, Простагландин Е2 | БМП-4, ЭФР, FGF-базовый, ФГФ-10, ХГФ, Ноггин, Wnt-3а | Н-2, ХЕПЕС, Л-раствор аланил-L-глутамина, пенициллин-стрептомицин |
| почка | ЧИР-99021、Ретиноевая кислота | БМП-2、БМП-4、БМП-7、FGF-основной 、ФГФ-9 | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| Лунгс | ЧИР-99021、СБ-431542 | Активин А、FGF-основной、ФГФ-4、Ноггин | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| Панкреас | Гастрин I、А 83-01、Никотинамид | ФГФ-10、 ЭФР、Ноггин、Р-Спондин 1、Wnt-3a | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| Простейт | Y-27632、СБ-202190、А 83-01、Никотинамид、Простагландин Е2、Тестостерон | ЭФР、Активин А、FGF-основной、ФГФ-10、Ноггин、R-Spond в 1、Wnt-10b | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| Маммаровая железа | Y-27632 | Здесь гулин β-1、Р-Спондин 1、Р-Спондин 2、Ноггин、ЭФР、 FGF-основной、ФГФ-10、Wnt-3a、Пролактин | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| Рэтина | ЧИР-99021、Y-27632 | Тсс、Wnt-3a | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| явнутреннее ухо | СБ-431542、А 83-01 | БМП-4、 FGF-основной | ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
| Бдождь | Y-27632、МК-2206、ГДК-0068、Дорзоморфин | FGF-основной、Ноггин、ДКК-1、 ЭФР、БДНФ、ГДНФ | Б-27, ХЕПЕС, Раствор L-аланил-L-глютамина, пенициллин-стрептомицин |
Срезюме из сМолекулы, обычно используемые в культуре органоидов: супер полезный, не забудьте добавить в закладки!
❶ Y-27632 (Кат. № 53006ES), Cat#52604ES): Это мощный ингибитор рока, который ингибирует p160ROCK (Ki=140 нМ) и ROCK-II (IC50=800 нМ) конкурентно с АТФ, а также ингибирует PRK2 (IC50= 600 нМ), и обычно его добавляют в первый раз при культивировании в посевной планшет, но не в последующей культуре.Y-27632 (10 мкМ) может ингибировать апоптоз стволовых клеток, повысить эффективность клонирования и продлить продолжительность жизни потомства клеток путем обработки эмбриональных стволовых клеток человека Y-27632 (10 мкМ) в течение 1 часа.
Рекомендуемая рабочая концентрация 10 мкМ
❷ SB-202190 (Cat#53005ES): мощный ингибитор киназы p38 MAPK, нацеленный на p38α/β. SB202190 индуцирует дифференциацию эмбриональных стволовых клеток человека в кардиомиоциты, способствует самообновлению нейральных стволовых клеток, и может быть использован в культурах органоидов желудочно-кишечного тракта и молочной железы.
Рекомендуемая концентрация растворения: 10 мг растворяют до 10 мМ, добавляя 3,018 мл раствора ДМСО и хранят порциями при температуре -20°C.
Рекомендуемая рабочая концентрация 10 мкМ
❸ CHIR-99021 (кат. № 53003ES): производное аминопиримидина, действующее как ингибитор GSK-3 (GSK3α/β), который индуцирует дифференциацию эмбриональных стволовых клеток человека в сторону энтодермы, и используется в культурах органоидов почек и сетчатки. ЧИР-99021, в сочетании с другими реагентами, стимулирует перепрограммирование соматических клеток в стволовые клетки.
Рекомендуемая концентрация растворения: 5 мг растворяют до 3 мМ, добавляя 3,58 мл раствора ДМСО, и хранят порциями при температуре -20 °C.
Ррекомендуемая рабочая концентрация: 3 мкМ
❹ A 83-01 (Cat#53002ES): ингибитор пути активина/NODAL/TGF-β, который подавляет активность киназы ALK5/4/7 и обычно используется при заболеваниях печени., простата, и культуры органоидов молочной железы, и часто используется для ингибирования дифференциации iPSC и поддержания самообновления клеток in vitro. Рекомендуемая концентрация растворения: 5 мг добавляют к 5,93 мл раствора ДМСО для растворения до 2 мМ, -20 ℃ разделить и хранить. (Особое примечание: этот продукт нестабилен в состоянии раствора), рекомендуется использовать его сейчас.)
Ррекомендуемая рабочая концентрация: 2 мкМ
❺ Гастрин I (Cat#53007ES): Гастрин — эндогенный гастроинтестинальный пептидный гормон, который стимулирует секрецию желудочной кислоты из клеток слизистой оболочки желудка. Гастрин связывается с рецептором холецистокинина B (CCKBR), что увеличивает внутриклеточный Ca2+, способствует выработке фосфатидилинозитола, и активация протеинкиназы С. Гастрин также участвует в пролиферации и дифференциации эпителиальных клеток желудка и используется при изучении органов, подобных желудочно-кишечным. Добавление гастрина требуется для продления выживаемости кишечных и печеночных органоидов в культуре.
Рекомендуемая концентрация растворения: 1 мг растворяют до 0,2 мМ, добавляя 2,38 мл 1% раствора аммиака и хранят порциями при температуре -20°C.
Ррекомендуемая рабочая концентрация: 10 нМ
❻ Никотинамид Никотинамид (кат. № 51402ES): витамин B3, участвующий в различных ферментативных окислительно-восстановительных реакциях и используемый в желудочно-кишечных, печень, и культуры органоидов молочной железы.
Никотинамид используется в сочетании с цитокинами и другими биохимическими веществами для проявления противовоспалительных свойств и стимуляции дифференциации МСК в инсулин-продуцирующие клетки., ингибировать активность сиртуинов, и способствовать формированию органоидов и продлевать продолжительность их жизни.
Рекомендуемая концентрация растворения: 100 мг растворяют до 100 мМ, добавляя 8,19 мл H2O (или ДМСО) и хранят порциями при температуре -20 °C.
Ррекомендуемая рабочая концентрация: 10 мМ
❼ Форсколин трихотецен (кат. № 51001ES): активирует аденилатциклазу и обычно используется для повышения внутриклеточного уровня цАМФ. Форсколин вызывает дифференциацию многих типов клеток и активирует PXR и FXR. Он обладает антикоагулянтным и антигипертензивным действием на тромбоциты и, в сочетании с другими малыми молекулами, может вызывать перепрограммирование фибробластов в iPSC. Это вещество необходимо добавлять в органоидные культуры печени. перепрограммируется в iPSC. необходимо добавлять во время культивирования органа, похожего на печень. Рекомендуемая рабочая концентрация: 1-10 мкМ
❽ Простагландин E2 (Cat#60810ES): Простагландин E2 (PGE2) регулирует многие физиологические системы., опосредует пролиферацию и дифференциацию клеток при связывании со специфическими рецепторами, необходимо добавлять в культуры органов, подобных печени и простате, и участвует в сохранении гладкой мускулатуры, воспаление, плодовитость, Регуляция цикла сна и целостность слизистой оболочки желудка.
Рекомендуемая концентрация растворения: 1 мг добавляют к 0,28 мл раствора ДМСО, растворяют до 10 мМ и хранят при температуре -20 °C порциями.
Рекомендуемая рабочая концентрация: 500 нМ.
❾ N-ацетил-L-цистеин (кат. № 50303ES): N-ацетил-L-цистеин (NAC) является предшественником антиоксиданта глутатиона., который обладает антиоксидантными свойствами, и ингибитор ROS, который подавляет апоптоз в нейрональных клетках, и который требуется добавлять в большинство органоидных культур.
Рекомендуемая концентрация растворения: 2 г добавляют к 24,51 мл H2O (или ДМСО), растворяют до 500 мМ и хранят при -20°C порциями.
Рекомендуемая рабочая концентрация: 1 мМ.
Продукт Рекомендациян
Маломолекулярные соединения (ингибиторы/активаторы)
| Название продукта | Номер по каталогу | Сспецификация |
| Ретиноевый кислота (ретиноевая кислота, ретиноевая кислота) | 100 мг/500 мг/1 г | |
| А 83-01 | 1 мг/5 мг/10 мг | |
| ЧИР-99021 | 2 мг/5 мг/10 мг | |
| СБ-431542 | 5 мг/10 мг/50 мг | |
| СБ-202190 | 5 мг/10 мг/25 мг | |
| Y-27632 | 1 мг/5 мг/10 мг | |
| Гастрин я (человек) | 1 мг/5 мг | |
| МК-2206 2HCl | 1 мг/5 мг/10 мг | |
| ГДК-0068 (Ипатасертиб; RG7440; GDC0068) | 53009ES | 1 мг/5 мг/10 мг |
| (Дорсоморфин) 2HCl) | 53010ES | 1 мг/5 мг/10 мг |
| Y-27632 дигидрохлорид | 5 мг/10 мг/25 мг | |
| Никотинамид | 1 г/5 г | |
| ДАПТ (GSI-IX, LY-374973) | 5 мг/25 мг | |
| Форсколин Волосы Горло | 10 мг/50 мг/100 мг/1 г | |
| Простагландин (ПГ) Е2 Простагландин Е2 | 60810ES | 1 мг |
| Тестостерон | 60803ES | 1 г/5 г |
| НАК (N-ацетил-L-цистеин) | 50303ES | 2 г |
| Репсокс | 5 мг/10 мг/25 мг | |
| LDN193189 (ДМ-3189) | 53012ES | 5 мг/10 мг |
СМИ и добавки
| Номер по каталогу | Сспецификация | |
| ХЕПЕС Бесплатно Кислота Клетка Культура Оценка | 60110ES | 100 г/500 г |
| L-аланил-L-глутамин решение, 200 мм L-аланил-Л-глютамин, 200 мм | 60701ES | 20 мл/100 мл/500 мл |
| Пенициллин-стрептомицин (100×), Подходящий для Клетка Cu литература Пенициллин-стрептомицин (Двойной Антитело) для С элл Культура |
100 мл | |
| Б-27 без сыворотки середина, 50 х | 60703ES | 10 мл |
| Н-2 добавка, сыворотка бесплатно, 100X Н-2 сыворотка бесплатно добавка, 100× | 60706ES | 5 мл |
Цитокин
| Название продукта | Номер по каталогу | Сспецификация |
| Рекомбинантный Человек Активин А | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| 10 мкг/100 мкг/500 мкг | ||
| Рекомбинантный Человек DKK-1 | 20 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек ЭФР | 100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек бФГФ | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек FGF-4 | 5 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек FGF-9 | 91305ES | 5 мкг/100 мкг/500 мкг |
| Рекомбинантный Человек FGF-10 | 91306ES | 5 мкг/100 мкг/500 мкг |
| Рекомбинантный Человек ГДНФ | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек Ноггин | 5 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек NRG1-бета1 | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек Р-Спондин 1 | 92274ES | 100 мкг/1 мг |
| Рекомбинантный Человек Тсс | 5 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек БАФФ | 5 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек sCD40 Лиганд | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек БМП-4 | 10 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек ХГФ | 5 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| Рекомбинантный Человек БДНФ | 5 мкг/20 мкг/100 мкг |
Мини-класс: Низкомолекулярные соединения — это соединения с молекулярной массой менее 1000 Да (особенно менее 500 Да), обладающие биологической активностью.В отличие от цитокинов и белков, Малые молекулы могут проникать в клетку через клеточную мембрану и выполнять свои биологические функции. Малые молекулярные соединения имеют широкий спектр целей и широко использовались во многих важных исследованиях области естественных наук, такие как стебель клетки, органоиды, иммунология, нейробиология, эпигенетика, апоптоз, ионные каналы, онкология и сигнальная трансдукция.
Ссылки
[1] Sato T, Stange DE и др. Долгосрочное расширение эпителиальных органоидов из толстой кишки человека, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта. Гастроэнтерология. 2011 ноябрь;141(5):1762-72. doi:10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2 сентября 2011 г. PMID: 21889923.
[2] Ланкастер МА, Реннер М и др. Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Nature. 2013;501(7467):373-379. doi:10.1038/nature12517.
[3] Греджио С. и др. Искусственные трехмерные ниши разрушают развитие поджелудочной железы in vitro. Развитие. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.
[4] Маккракен К.В. и др. Моделирование развития и заболеваний человека в желудочных органоидах, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.
[5] Zhao B, Ni C и др. Повторение инфекции SARS-CoV-2 и повреждения холангиоцитов с помощью протоковых органоидов печени человека. Protein Cell. 2020 октябрь;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.
[6] Ку М., Сюн Л. и др. Создание культур кишечных органоидов, моделирующих регенерацию эпителия, связанную с травмой. Cell Res. 2021 март;31(3). 259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 янв. 8. PMID:
[7] 33420425; PMCID: PMC8027647.
[8] BlueRock Therapeutics объявляет о первом пациенте, которому была введена доза DA01 в исследовании фазы 1 у пациентов с прогрессирующей болезнью Паркинсона. Пресс-релиз BlueRock Therapeutics: 8 июня 2021 г.
[9] Такасато М., Эр П.К. и др.Органоиды почек из человеческих iPS-клеток содержат множественные линии и моделируют человеческий нефрогенез. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.
[10] Спенс Дж. Р., Мэйхью К. Н. и др. Направленная дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток в кишечную ткань in vitro. Nature. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.
